目的:　　 观察谷氨酰胺(Gln)在内毒素血症时对幼年大鼠小肠上皮信号转导通路ERK、p38活性的影响,探讨谷氨酰胺对内毒素血症幼年大鼠小肠上皮的保护机制。　　 方法:　　 选清洁级18日龄Wistar大鼠96只(由中国医科大学实验动物中心提供),雌雄不拘,体质量(27.0±4.0)g。随机分成对照组(腹腔注射生理盐水1mL/kg);LPS组(腹腔注射内毒素5mg/kg,配比浓度为5g/L,用生理盐水溶解),;Gln组(谷氨酰胺组腹腔注射内毒素同时腹腔注射N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺2g/kg,浓度20%,含L-谷氨酰胺13.46%),每组2、6、24、72h各时点8只。各组于上述指定时间点以脊椎脱臼法处死,取全部回肠,用冰盐水灌洗清除小肠内容物,分别置于4%多聚甲醛固定12～16h留取组织标本,进行常规HE染色,光学显微镜观察组织大体改变,免疫组化染色;取回肠组织切块(1mm*1mm*1mm)投入2.5%戊二醛固定液固定,梯度酒精脱水,Epon包埋后制成超薄切片,在透射电镜下观察小肠粘膜超微结构;迅速取回肠组织于EP管液氮中速冻后移至-80℃冰箱中保存用做Real-timePCR进行实时定量分析。　　 免疫组化染色及结果判定方法:采用免疫组化二步法检测对照组、内毒素组、谷氨酰胺组中ERK和P38蛋白的表达。ERK鼠单克隆抗体、p38兔多克隆抗体均购自北京中杉金桥生物有限公司,工作浓度为1:50,免疫组化及DAB显色试剂盒购自北京中杉生物有限公司。用PBS代替一抗做阴性对照。结果判定:ERK和p38蛋白在细胞浆或细胞核中呈现清晰棕黄色特异性免疫反应颗粒为阳性细胞。取组化染色片(阳性者表现为胞质或胞核棕黄色颗粒),在每张切片上随机选取5个视野照相,采用日本产OLYMPUS摄像系统和MetaMorph/BX41型图像数据分析系统测定积分吸光度值,进行数据分析。　　 Real-timePCR与结果判定:按TRIZOI法抽提总RNA(按试剂说明书提取总RNA);并经紫外分光光度计测定,计算提取RNA浓度和纯度;并对总RNA完整性进行鉴定;反转录扩增cDNA:进行PCR扩增(取cDNA3U1(1ug),10*Buffer2uL,Mgc124U1,10mmol/LdNTPs2uL,引物100ng,TagDNA多聚酶1uL,总体系20uL。循环条件:Stage1:预变性95℃30秒20℃/秒;Stage2:PCR反应95℃5秒20℃/秒,60℃20秒20℃/秒;Stage3:溶解曲线分析95℃0秒20℃/秒,65℃15秒20℃/秒,95℃0秒0.1℃/秒,共41个循环。结果判定:确认Real-timePCR反应的扩增曲线及溶解曲线,判断扩增效率及特异性,调节基线至适宜处(指数扩增的起始处),各扩增曲线与基线的交叉点对应的即为CT值:采用deltadeltaCT相对定量法进行分析。　　 结果:　　 注药后表现:内毒素组幼年大鼠注药后出现腹泻、呼吸加快、口唇、四肢及尾巴青紫,四肢末梢凉,腹胀加重,对外界声音刺激反应能力明显下降或不出现反应等临床表现均较谷氨酰胺组出现早并且重。内毒素组总体亡率约为15%,谷氨酰胺组总死亡率为10%左右。对照组未见明显异常,3d内体质量增长良好。病理改变及电镜观察:HE染色后光镜下对照组小肠黏膜结构正常,LPS组和谷氨酰胺组各时点小肠粘膜有不同程度的充血、水肿及炎症改变,Gln组各时点与LPS组比较均减轻:电镜下观察对照组小肠上皮超微结构正常,LPS组可出现染色质边集、浓缩、核碎裂甚至出现凋亡小体,Gln组各时点与LPS组比较小肠上皮炎症反应表现均有所减轻。免疫组化:LPS组和Gln组各时点小肠上皮细胞可见沉积于胞质或胞核棕黄色ERK-2及P38颗粒明显高于对照组。LPS组ERK及p38表达较Gln组相同时点增强,以6h差异最显著,有统计学意义(P≤0.05)。Real-timePCR:LPS组及Gln组ERK及p38的rnRNA表达均较对照组增高,LPS组较Gln组ERK和p38表达增高,差异有统计学意义(P≤0.05)。　　 结论:　　 ERK及p38在内毒素组中的阳性表达率显著高于对照组,提示二者参与了小肠上皮细胞凋亡的发生。ERK与p38在谷氨酰胺组明显低于内毒素组的表达,提示二者在谷氨酰胺作用于内毒素血症的重要价值及其机制。