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背景:心力衰竭是多种心脏疾病发展的终末阶段,心脏重构是是心力衰竭的重要危险因素。目前针对心脏重构的药物疗效有限,寻找新型药物对于心力衰竭的防治具有重要意义。在2型糖尿病患者的治疗中,钠-葡萄糖共转运蛋白2(Sodium glucose co-transporter 2,SGLT2)抑制剂能够降低因心力衰竭而首次住院的风险。临床研究表明,SGLT2抑制剂的心血管保护作用可能与其降糖作用无关,但具体机制仍然未知。目的:1.观察在非糖尿病状态下,SGLT2抑制剂达格列净(dapagliflozin,DAPA)对Ang Ⅱ诱导的大鼠心脏重构和心脏功能障碍的影响,探讨DAPA对TGF-β/Smad通路以及Na+/H+交换体-1(Na+/H+exchanger-1,NHE-1)表达的影响。2.观察DAPA对Ang Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)纤维化的影响,研究DAPA对CFs胞内钙离子浓度的影响和机制,探讨SGLT2抑制剂DAPA改善Ang Ⅱ诱导的心肌纤维化的作用和可能机制。方法:动物实验:使用填充有Ang Ⅱ的胶囊渗透泵(ALZET(?)Osmotic Pumps 2006,DURECT),持续泵入Ang Ⅱ 520 ng/(kg·min)4周建立大鼠心脏重构模型,建模第2天灌胃给予DAPA 5 mg/kg。24只雄性SD大鼠随机分为4组:(1)对照组(Control,CTL,n=6);(2)对照+达格列净组(CTL+DAPA,n=6);(3)血管紧张素Ⅱ组(AngⅡ,n=6);(4)血管紧张素Ⅱ+达格列净组(AngⅡ+DAPA,n=6)。通过超声心动图评估心脏的结构和功能,H&E染色观察组织的结构,天狼星红染色和Masson染色观察心脏组织胶原沉积,免疫组织化学法检测胶原纤维I、III、α-SMA以及TGF-β1的表达,Western blot检测胶原纤维I、III、α-SMA、TGF-β/Smad通路蛋白、NHE-1蛋白的表达。细胞实验:使用Ang Ⅱ(1μM)和不同浓度梯度的DAPA(0.5、1、10μM)干预CFs 24h。应用钙离子荧光探针Fluo-3AM标记胞浆内游离的钙离子,通过流式细胞术和免疫荧光的方法评估细胞内Ca2+浓度,Western blot检测胶原纤维I、III、成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的标志物α-SMA、TGF-β/Smad通路蛋白、NHE-1蛋白的表达。结果:动物实验:1.超声心动图结果显示,与CTL组相比,Ang Ⅱ组大鼠的舒张末期室间隔厚度,舒张期左心室后壁厚度,左心室短轴缩短率和左室射血分数升高;而左心室舒张末期内径,左心室收缩末期内径,舒张末期容积,收缩末期容积降低。而在使用DAPA治疗后,这些指标均显著改善。同时,各组大鼠的血压、血糖、血脂以及生化指标没有明显变化。2.Ang Ⅱ组大鼠的心脏质量指数、心肌细胞横截面积、ANP、BNP、Ang Ⅱ水平均较CTL组明显增加,DAPA治疗后心脏质量指数、心肌细胞横截面积、ANP、BNP、Ang Ⅱ水平明显减小。3.天狼星红染色和Masson染色结果显示,Ang Ⅱ组阳性区域较CTL组明显增多,呈明显的片状、网状,而AngⅡ+DAPA组阳性区域明显减少。免疫组织化学以及Western blot结果显示AngⅡ组胶原纤维I、III、α-SMA的表达显著增加,而AngⅡ+DAPA组的表达明显降低。4.Western blot的结果显示,与CTL组相比,Ang Ⅱ组心肌组织中TGF-β1的表达以及p-Smad2/Smad2和p-Smad3/Smad3的比例显著增加,TGFβ/Smad通路的抑制分子Smad7的表达下降,而AngⅡ+DAPA组中TGF-β1的表达以及p-Smad2/Smad2和p-Smad3/Smad3比例降低,Smad7的表达升高。此外,在Ang Ⅱ组大鼠心肌组织的NHE-1的表达量较CTL组明显升高,而在DAPA治疗之后,NHE-1的表达量明显减少,这表明DAPA可能通过抑制TGF-β/Smad通路以及抑制NHE-1的表达,发挥其心脏保护作用。细胞实验:1.在体外实验中,与CTL组相比,Ang Ⅱ使CFs的Collagen I、Collagen III、α-SMA以及TGF-β1的表达增加,而DAPA干预之后使这些纤维化相关的蛋白表达减少,并且呈一定的剂量依赖的方式。2.Ang Ⅱ增加了NHE-1蛋白的表达,而DAPA可以使NHE-1的表达量有明显的下降。此外,流式细胞术和免疫荧光结果显示,AngⅡ使细胞内Ca2+浓度明显升高;而DAPA可以降低细胞内Ca2+浓度,这表明DAPA可能通过影响细胞内Ca2+的浓度减轻纤维化。结论:1.DAPA可以改善Ang Ⅱ诱导的非糖尿病大鼠心脏重构和心脏功能障碍,其机制可能与抑制TGF-β/Smad通路以及NHE-1的表达有关。2.DAPA可以减轻Ang Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化以及其ECM蛋白的产生,其机制可能与降低细胞内Ca2+浓度以及抑制NHE-1的表达有关。