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本论文对镇江地区7、8、9、10、11月份采集的喙果绞股蓝黄酮类成分进行初步研究。首先建立了喙果绞股蓝总黄酮含量的测定方法,并结合响应面分析,研究喙果绞股蓝的总黄酮提取工艺,并探索了不同月份喙果绞股蓝总黄酮的含量变化;建立了RP-HPLC同时测定喙果绞股蓝中芦丁和槲皮素含量的方法,研究了不同月份喙果绞股蓝中芦丁和槲皮素的含量变化;考察了不同月份喙果绞股蓝总黄酮的体外抗氧化活性,最后研究对喙果绞股蓝中黄酮类化合物结构进行初步鉴定。具体研究结果如下:
(1)建立了喙果绞股蓝黄酮类成分含量测定紫外分析方法,建立了芦丁标准曲线,C=0.1932A-0.0253,相关系数R2为0.9992,线性关系良好,线性范围在0.0198mg/mL~0.119 mg/mL之间,该方法准确、简单、重复性好,可用于喙果绞股蓝总黄酮含量测定。
(2)研究了喙果绞股蓝总黄酮提取工艺,首先利用单因素试验筛选初步的优化提取因素,提取溶剂80%乙醇、提取温度80℃、提取时间150 min、提取料液比1:40、提取次数2次。通过响应面分析法,回归拟合程度好(P=0.0421<0.05),相关系数r=0.9810,软件模拟喙果绞股蓝总黄酮提取的最佳工艺条件为:乙醇浓度80.11%、提取温度80.59℃、提取时间147.67 min、料液比为1:40、提取两次。考虑实际操作,将喙果绞股蓝的最佳提取条件为:乙醇浓度80%、提取温度81℃、提取时间148 min、料液比为1:40、提取两次。
(3)7、8、9、10、11月份的喙果绞股蓝总黄酮含量随月份变化而变化,,各月总黄酮含量依次为0.96%、1.54%、1.24%、1.04%、0.64%,其中8月的总黄酮含量最大,为1.54%,11月份的总黄酮的含量最低,为0.64%,各月份总黄酮含量差异较大。
(4)建立RP-HPLC同时测定喙果绞股蓝中芦丁、槲皮素的方法,流动相条件为,甲醇-0.4%磷酸水溶液梯度洗脱(0~20 min,40%:60%,20~60 min,50%:50%,60~75 min,60%:40%,75~90 min,70%:30%,v/v);检测波长:364 nm;流速:1 mL/min;柱温:常温。该方法简便、准确度高、重复性好,为喙果绞股蓝质量控制提供试验依据。
(5)7、8、9、10、11月份喙果绞股蓝中芦丁、槲皮素的含量随月份变化而变化,具有动态变化规律,呈先升高后下降的趋势,芦丁在8月份时含量最高,平均质量分数达5.54 mg/g,槲皮素在9月份时含量较高,平均质量分数达0.81.mg/g,各月份含量差异较大。
(6)7、8、9、10、11月份喙果绞股蓝总黄酮具有抗氧化活性,7~11月喙果绞股蓝总黄酮消除超氧阴离子自由基(O2-·)能力,随着供试品浓度的增大而增加,半消除率IC50分别为0.58 mg/mL、0.407 mg/mL、0.48 mg/mL、0.477 mg/mL、0.534 mg/mL,8月份消除能力最高,7月份最低;消除羟基自由基(·OH)能力随着供试品浓度的增加而增大,半消除率IC50分别为0.495 mg/mL、0.469 mg/mL、0.378 mg/mL、0.427 mg/mL、0.413 mg/mL,9月份消除能力最高,7月份最低;消除1,1-二苯基-2-苦苯腈自由基(DPPH·)能力随着供试品浓度的增加而增大,半消除率IC50分别为0.57 mg/mL、0.513 mg/mL、0.478 mg/mL、0.543 mg/mL、0.619mg/mL,9月份消除能力最高,11月份最低;还原能力随着供试品浓度的增加而增大,当供试样品浓度为0.1.25 mg/mL,各月份吸光度值依次分别为0.274、0.296、0.257、0.372、0.247,10月份还原能力最高,11月份最低。
(7)通过黄酮类化合物的颜色反应初步鉴定喙果绞股蓝中黄酮类化合物可能存在的成分:游离的黄酮类或黄酮苷、黄酮醇类、2-OH查耳酮或5-OH黄酮类。通过与芦丁、槲皮素标准品对照,TLC展开剂为氯仿:甲醇:甲酸=8.8:1:0.1时能较好的分离芦丁和槲皮素,其中芦丁和槲皮素的Rf值分别为0.146和0.306,证明喙果绞股蓝中含有芦丁与槲皮素。通过LC-MS进一步分析,喙果绞股蓝中含有芦丁、槲皮素、商陆素、商陆甙。