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目的:前期实验证明,敲低或抑制磷酸二酯酶-4(phosphodiesterase-4,PDE4)能抑制脑内炎症反应,但是机制尚未完全清楚。最近几年有报道cAMP能诱导自噬,另一方面,研究发现自噬活动调控炎症反应,而抑制自噬能使炎症反应失控。新型PDE4抑制剂罗氟普兰(Roflupram,ROF)能提高cAMP水平和抑制炎症,但是ROF能否能通过提高cAMP水平诱导小胶质细胞自噬并通过诱导自噬发挥抗炎作用仍待探讨。方法:(1)使用MTT法检测不同浓度ROF对正常及活化的BV-2小胶质细胞生存率的影响;(2)Western blot检测自噬相关蛋白、NLRP3炎性小体通路相关蛋白、凋亡相关蛋白、突触相关蛋白水平的变化;(3)AO、LYT染色标记细胞内酸性囊泡;(4)LC3免疫荧光检测自噬水平变化;(5)使用药理学自噬抑制剂3-MA及基因组学siRNA ATG7转染抑制自噬;(6)采用CQ检测自噬潮;(7)ELISA检测细胞因子;(8)Hoechst染色和相差显微镜检测凋亡N2a细胞及存活细胞突触变化;(9)条件培养基共培养系统评价BV-2小胶质细胞介导的炎性微环境对N2a的损害及PDE4抑制剂ROF的保护作用。结果:(1)MTT的结果显示,ROF在0.625-20μM的浓度范围内不对正常BV-2细胞的活力产生影响,ROF(10 μM)与LPS+ATP及Aβ25-35刺激的BV-2细胞有良好相容性。(2)Western blot结果显示,与溶剂对照组相比,ROF增加BV-2小胶质细胞内的LC3-Ⅱ蛋白水平且呈剂量依赖性(2.5-10 μM)和时间依赖性(2-8h),p62的改变与LC3-μ的改变呈负相关;自噬潮检测显示,与溶剂对照组相比,CQ(20M)处理后,BV-2细胞LC3-Ⅱ蛋白水平升高,而ROF(5μM)与CQ(20 μM)联用后,LC3-Ⅱ蛋白水平显著升高,比单独CQ组的LC3-Ⅱ水平更高。另外,ROF在AO及LYT染色中都使BV-2细胞酸性囊泡荧光增加;自噬抑制剂3-MA(1 mM)能逆转ROF的作用。这些结果显示ROF诱导了 BV-2细胞自噬;雷帕霉素、咯利普兰和毛喉素在AO和LYT染色中的显示的变化与ROF相似,提示cAMP信号通路可能参与其自噬的诱导。(3)相差显微镜结果显示,与对照组相比,LPS(1μg/ml)+ATP(1 mM)或Aβ25-35(5 μM)在刺激6 h后明显激活BV-2小胶质细胞,另一方面,Western blot结果显示,被激活BV-2小胶质细胞在功能上发生相应的改变,包括自噬诱导和NLRP3炎性小体通路活化,表现为自噬标记物LC3-Ⅱ增加和NLRP3炎性小体通路活化相关蛋白IL-1β p17、Caspase-1 p10和NLRP3水平的增加。(4)ELISA结果显示,与溶剂对照组相比,ROF对细胞释放IL-1β无明显影响,但在联合LPS+ATP或Aβ25-35处理BV-2细胞后,剂量依赖性减少NLRP3炎性小体通路的细胞因子产物IL-1β的释放,而且Western blot结果显示,与LPS+ATP或Aβ25-35组相比,ROF增加活化BV-2细胞LC3-Ⅱ,同时减少其IL-1βp17和Caspase-1 p10,该作用能被自噬抑制剂3-MA逆转,表明ROF诱导活化的BV-2细胞自噬,同时抑制LPS+ATP和Aβ25-35对活化BV-2细胞NLRP3炎性小体通路的激活,该作用与其自噬诱导作用有关;另外,与LPS+ATP和Aβ25-35组相比,ROF与LPS+ATP或Aβ25-35组共培养使BV-2细胞内的pro-IL-1β和NLRP3减少,提示ROF的自噬介导的抗炎作用与自噬性降解pro-IL-1β和NLRP3有关。(5)在进一步研究小胶质细胞介导的炎症对神经元的毒性作用实验中,收集不同方法处理的BV-2小胶质细胞条件培养基,用于培养N2a神经元细胞24h。Hoechst结合相差显微镜结果显示,LPS+ATP和Aβ25-35处理BV-2细胞的条件培养基增加N2a细胞凋亡和神经损伤,ROF在一定程度上能间接改善该损伤,而该作用能被3-MA逆转;Western blot检测进一步验证了形态学结果,表现为LPS+ATP和Aβ25-35处理BV-2细胞的条件培养基升高N2a细胞凋亡相关蛋白Caspase-3和突触相关蛋白PSD95水平,ROF在一定程度上抑制其升高,而该作用能被siRNA ATG7逆转,提示ROF自噬介导的抗炎作用能在一定程度上减轻BV-2小胶质细胞介导的神经炎症反应对N2a细胞的毒性。结论:(1)PDE4抑制剂ROF能诱导正常及活化的BV-2小胶质细胞自噬,该作用可能与cAMP信号通路有关。(2)NLRP3炎性小体特异性激活剂LPS+ATP和Aβ25-35能激活BV-2细胞及其NLRP3炎性小体通路(刺激6 h),而ROF能减轻它们的激活作用,ROF该作用与其诱导自噬、自噬性降解NLRP3炎性小体成分NLRP3和pro-IL-1 β有关。(3)LPS+ATP和Aβ25-35激活NLRP3炎性小体通路和BV-2细胞介导的神经炎症损伤N2a神经元,ROF通过自噬介导抑制BV-2细胞NLRP3炎性小体通路活化的作用,间接减少N2a神经元细胞的损伤。