细胞内游离Ca²⁺作为细胞内第二信使，具有重要的生物学功能。因此，细胞内游离Ca²⁺的浓度和时空分布的研究已成为化学、生物学和基础及临床医学等学科重要的前沿热点研究课题。目前，细胞内游离Ca²⁺的研究主要借助先进的荧光图像分析技术和Ca²⁺荧光探针来实现的，但迄今为止，尚未见既可长波激发、又与Ca²⁺结合后荧光峰有位移、可无损伤的导入细胞、且对胞内Ca²⁺测定具有双靶向性、可同时对胞质Ca²⁺和胞核Ca²⁺进行测定的整体性能优良的Ca²⁺荧光探针及其应用的研究报道。 本论文的研究主要开展了以下几个方面：1．合成了新型Ca²⁺荧光探针STDBT的AM酯型STDBT—AM，使该探针可无损伤性的导入细胞。2．系统研究了新型Ca²⁺荧光探针STDBT的光谱性能包括吸收光谱、荧光光谱、荧光寿命和荧光量子产率；6种不同类型细胞标记性能和它在四种不同的活性氧体系中的耐氧化性能。3．以所合成的STDBT—AM为细胞Ca²⁺荧光探针，采用共聚焦技术，进行了不同类型细胞受刺激之后胞内游离Ca²⁺浓度变化的实时监测，探讨了细胞内游离Ca²⁺动员的机制，并与Fluo-3进行比较。 本研究论文主要包括以下三个部分： 一．概述 本文对目前常用的几种细胞Ca²⁺测定方法，特别是钙荧光指示剂法中细胞Ca²⁺荧光探针的合成研究及测定方法进行了较为详尽的综述。 二．新型细胞Ca²⁺荧光探针STDBT—AM的合成及其性能研究 1．新型Ca²⁺荧光探针STDBT—AM的合成 将合成的具有靶向性、可长波激发、与Ca²⁺结合前后荧光峰有较大位移的新型Ca²⁺荧光探针STDBT制成AM酯型导入细胞。 2．新型Ca²⁺荧光探针的性能研究 系统研究了所设计合成的Ca²⁺荧光探针STDBT的分析性能，包括吸收光谱、荧光光谱、细胞荧光标记特性和耐氧化性能。结果表明，所合成试剂STDBT既具备双波长Ca²⁺荧光探针Fura-2与Ca²⁺结合前后吸收和荧光峰有位移，又保持了长波长Ca²⁺荧光探针Fluo-3荧光激发波长位于可见光区的特性且与Ca²⁺的亲和力较小，适合细胞Ca²⁺的动态测定。同时细胞荧光图像分析显示，STDBT—AM进入细胞后既标记胞质又标记胞核，且胞核、胞质边缘界限清晰明显，是目前唯一的可以AM酯型无损伤导入细胞、双波长、可见光激发、具有亚细胞区域定位性的人工合成小分子Caz+荧光探针。并且其水溶性好，在细胞内较Fluo一3等更易于负载，耐氧性较目前常用的两种Caz+荧光探针F²和Fluo一3好，氧化剂对STDBT与C扩+的亲和力的影响较小。试剂整体性能优于目前国内外广泛采用的c犷+荧光探针。三.新型ca2+荧光探针的应用 1.新型ca2+荧光探针sTDBT测定血清中游离ca2+ 利用指示剂sTDBT在 PH一7.2的中性缓冲介质中，可与c扩十络合形成稳定的络合物，且络合前后吸收峰有较大位移这一特点，建立了一种在生理条件下，采用双波长比率法测定血清中游离c犷+的新方法。 2.肾上腺素诱导不同运动负荷大鼠心肌细胞胞质、胞核ca2+的动员机制研究 采用激光共聚焦显微术，应用所合成的新型caz+荧光探针smBT一AM研究了肾上腺素诱导大鼠心肌细胞c扩+动员的机制，探讨了心肌细胞胞核caz+与胞质caz+的调节是否具有独立性，并比较了不同运动负荷大鼠心肌细胞内c扩+的含量、分布变化情况，且与Fluo一3进行了比较。表明所合成探针SrTDBT一AM是目前国内外唯一的可以AM酉旨型无损伤导入细胞、双波长、可见光激发的双靶向胜的caz+荧光探针，’肾上腺素诱导心肌细胞中核[C扩+]。是通过T型c扩+通道促进外c犷十内流。 3.sTDBT用于瘦素对生长激素细胞胞内ca2+变化的影响 将所合成的新型c犷十荧光探针sTDBT一AM用于生长激素细胞，研究了减肥药一瘦素对细胞中C犷十浓度的影响，并与Fluo一3一AM对生长激素细胞的标记及其对胞内游离C扩十浓度变化的响应等特性进行了比较。结果表明，与Fluo-3不同，新型C扩+荧光探针STDBT对胞核c扩+具有很强的靶向胜，当它与Fluo一3一起标记细胞时它能完全占有细胞核，但却不进入核仁，是一种真正的胞核C扩十荧光探针，且其荧光发射峰位于长波长区域，它发射的为红色荧光。对瘦素诱导的胞内游离c扩+浓度变化的响应较Fluo一3更灵敏迅速。 4.双靶向性c扩十荧光探针sTDBT一AM用于K562细胞胞核caz+和胞质ca2+的调节机理研究 利用新型caz+荧光探针smBT-A加I的双靶向胜，结合激光共聚焦技术研究了K562细胞胞核[C内。和胞质[C扩勺。的调节机制。结果表明在K562细胞中胞核Caz十和胞质c犷十在行使其信使作用时具有相对独立性，激动剂诱导胞质[C内。的升高主要来自外c尹内流和内c犷+释放，而胞核[C矛勺。升高主要依赖于内c犷+释放，即核被膜紧邻外周的内c扩+释放和被认为是核caz+库的核被膜空腔的内caz+释放。