引言:肾细胞癌是泌尿系肿瘤中最常见的恶性肿瘤,近年来发病率不断增高。肾透明细胞癌(ccRCC)是肾细胞癌的主要类型,约占75%,同时也是预后最差、致死率最高的类型,此类癌症如果发生远处转移,患者五年生存率将不足9%。虽然临床手术水平不断提高,但是长期的预后改善仍不令人满意。因此,阐明介导肾透明细胞癌侵袭迁移的分子机制是当前研究与治疗的亟待解决的问题。近期众多研究表明蛋白的合成异常在肿瘤发展进展中起了重要作用,而转录起始过程是蛋白合成的关键限速过程。转录起始因子家族(eIFs)是介导mRNA翻译的一类关键因子,其中eIF3是十二个已知的真核转录因子中最大、最重要的多亚基复合物,而eIF3b是eIF3中的核心亚基并且是主要的折叠蛋白,而其他拥有不同亲和力的亚基结合在eIF3b上。这个平台可以征募其他蛋白成分用以形成起始前复合物43S,此外,eIF3b可以与eIF4G相互作用,形成了可以结合AUG起始密码子的起始前复合体48S。研究表明,这些eIF3的亚基,是多种癌症潜在的预后分子标记物,包括eIF3a、eIF3c、eIF3e、eIF3h、eIF3i和eIF3m等,他们更容易被检测到,未来可能会是一类新的肿瘤治疗方法的基石,其中eIF3b在结肠癌、恶性胶质瘤、食管鳞状细胞癌和膀胱癌中可作为预后因子,然而目前eIF3b在肾透明细胞癌中的预后价值和生物学作用尚不清楚,且这些研究都未深入探讨eIF3b的作用机制。本研究为深入了解eIF3b的生物学功能及其潜在分子机制,将从蛋白组学、转录组学,并结合诸多细胞生物学技术,从临床研究、细胞实验、动物实验三个角度充分阐明eIF3b在肾癌发生发展中的生物学作用及其预后意义,最终为ccRCC的研究和靶向治疗的研究提供理论依据。第一部分:翻译起始因子eIF3b在ccRCC中的表达及其预后价值——肿瘤eIF3b是ccRCC患者独立预后因子研究目的1.检测eIF3b在ccRCC中表达水平,并明确其表达水平与临床各项指标的关系;2.分析eIF3b临床预后价值。研究方法1.收集临床标本,利用蛋白电泳(Western Blotting)和免疫组化(IHC)等技术检测eIF3b在ccRCC患者中癌组织中表达水平;2.利用相关性分析检测eIF3b免疫组化染色结果与临床各项指标的相关性;3.利用单因素和多因素COX回归模型分析明确肿瘤eIF3b的表达与患者预后的关系。研究结果1.82例透明细胞癌患者中,45例患者癌组织eIF3b表达阳性,且在细胞核与细胞质中均有表达。eIF3b蛋白表达水平与Furhman核分级呈正相关(p=0.044),与TNM分期无明显相关性;2.临床病例资料Kaplan-Meier生存曲线分析显示高表达eIF3b蛋白、较高TNM分期和高级别Furhman核分级均与不良预后相关。COX多因素分析显示肿瘤eIF3b蛋白表达水平和TNM分期是肾透明细胞癌患者的独立预后因子。研究结论eIF3b的表达水平可作为ccRCC患者的预后标志物,eIF3b表达越高,患者预后越差。第二部分:eIF3b在ccRCC中的生物学作用的研究——敲低eIF3b抑制了细胞增殖、迁移和侵袭研究目的1.细胞实验探究和讨论eIF3b在肾透明细胞癌中的生物学作用;2.利用动物实验,探究肿瘤eIF3b作为靶向治疗靶点的可行性,表明靶向敲低eIF3b表达对肿瘤治疗的指导意义。研究方法1.应用小干扰技术靶向敲低肾癌细胞株786-o和A498中eIF3b的表达水平;2.细胞增殖实验和集落形成实验检测eIF3b敲低对细胞的增殖情况的影响;3.细胞划痕实验和Transwell实验检测eIF3b敲低后细胞侵袭迁移能力的变化情况;4.裸鼠皮下成瘤实验探究eIF3b靶向敲低后,肾癌细胞系成瘤能力的变化。研究结果1.用小干扰技术靶向敲低eIF3b的表达后,肾癌细胞A498和CAKI-2的增殖能力、迁移能力和侵袭能力受到了抑制;2.裸鼠皮下成瘤实验中,使用稳定敲低eIF3b表达的细胞,其形成的裸鼠肿瘤组织生长减缓,即eIF3b敲低后抑制了裸鼠肿瘤的生长。研究结论1.体外细胞实验证实抑制eIF3b的表达可以抑制肾癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。体内实验表明敲低eIF3b抑制了肿瘤的生长;2.eIF3b是ccRCC潜在的靶向治疗靶点。第三部分:肿瘤eIF3b生物学作用机制的研究——eIF3b通过调节Akt和β-catenin通路调节细胞周期、凋亡和EMT研究目的探究eIF3b在肾透明细胞癌中生物学作用的潜在机制。研究方法1.流式细胞技术检测细胞敲低eIF3b后细胞周期和凋亡情况的变化;2.利用蛋白电泳实验,检测周期凋亡相关蛋白,以验证流式细胞周期和凋亡的变化结果;3.利用蛋白电泳实验检测细胞上皮细胞-间充质转化(EMT)过程中相关蛋白的变化,以检测EMT是否参与了细胞侵袭迁移的变化,并验证细胞侵袭迁移变化的结果;4.利用蛋白电泳实验,检测eIF3b敲低后,细胞增殖、周期、凋亡的上游Akt通路相关蛋白的变化,以探究eIF3b介导细胞增殖、周期、凋亡等的分子机制;5.利用蛋白电泳实验,检测eIF3b敲低后,EMT上游β-catenin通路的相关蛋白变化,以探究细胞侵袭、迁移能力变化的分子机制。研究结果1.eIF3b蛋白的表达降低后,流式细胞周期检测到细胞分裂周期受到了阻滞,即细胞由G1期进入S期过程受到阻滞。深入的蛋白电泳结果显示,eIF3b敲低后,除了 Gl/S,G2/M过程中相关蛋白的变化提示G2/M也受到了阻滞;2.eIF3b敲低后,流式细胞凋亡技术检测到细胞凋亡增加了。蛋白电泳结果显示,eIF3b表达降低后,凋亡相关蛋白的变化,在蛋白层次上验证了凋亡增加的结果;3.eIF3b敲低后,上皮细胞标记物E钙黏素表达上调,EMT的抑制蛋白Slug和Snail表达降低;此外,间质细胞标记物N钙黏素和Vimentin表达降低。这提示eIF3b表达降低后,EMT过程受到抑制。蛋白电泳显示,EMT上游调控蛋白β-catenin表达显著降低,其靶向作用靶点蛋白Cyclin D表达也降低了,提示eIF3b敲低后,β-catenin通路的下调是EMT受抑制的原因;4.Akt通路相关蛋白的电泳结果显示eIF3b敲低后,Akt通路受到了抑制,这其中包括调节细胞骨架和细胞粘附力的integrin/FAK/Akt通路、调节细胞增殖凋亡和细胞生存的Akt/mTOR/HIF通路和调节细胞凋亡的Akt/GSK-3β通路。研究结论1.敲低eIF3b通过抑制细胞周期和促进细胞凋亡来抑制肾癌细胞的增殖;2.抑制eIF3b的表达水平可以下调β-catenin通路,进而抑制上皮向间质细胞转化(EMT),从而抑制了细胞侵袭和迁移;2.Akt 通路受抑制,包括 integrin/FAK/Akt、Akt/mTOR/HIF、Akt/GSK-3β通路等,也是eIF3b敲低后细胞生物学改变的主要原因之一。第四部分:癌旁eIF3b的临床预后价值的探究——癌旁eIF3b是抑癌蛋白研究目的1.检测ccRCC癌旁组织eIF3b的表达情况并探究其与临床各指标的关系;2.明确癌旁eIF3b临床预后价值;3.探索肿瘤和癌旁eIF3b表达量的关系研究方法1.收集临床标本,利用实时荧光定量PCR(RT-PCR),蛋白电泳(Western Blotting)和免疫组化(IHC)等技术检测eIF3b在ccRCC患者癌旁组织的表达水平;2.检测癌旁eIF3b的表达与临床各指标的相关性;3.单因素和多因素COX回归模型分析明确癌旁eIF3b与预后的关系;研究结果1.与肿瘤组织相比,癌旁eIF3b蛋白表达增高(p=0.04),且癌旁eIF3b的表达与肿瘤的T分级相关(p=0.046);2.Kaplan-Meier生存分析显示高表达的eIF3b跟患者较好的预后相关(p=0.047)。研究结论癌旁eIF3b的表达增高跟患者良好的预后相关,提示癌旁eIF3b的高表达可能是正常组织的保护应激反应,其生物学作用与肿瘤eIF3b似乎相反。