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苯乳酸(phenyllactic acid,PLA)广泛存在于泡菜、蜂蜜等多种食物中,是一种新型天然抑菌物质、防腐剂,能够抑制一系列的革兰氏阴性、阳性细菌以及真菌,并且对心血管系统具有明显的改善和保护作用,已经被广泛应用于食品以及医药行业。苯乳酸有D型与L型的两种同分异构体,其中D型苯乳酸(D-PLA)具有更高的抗菌活性。本研究利用大肠杆菌作为全细胞催化剂,通过高效表达D-乳酸脱氢酶以及苯丙氨酸转氨酶,引进辅因子循环系统,优化转化体系条件,排除转化体系中的产物抑制及提高大肠杆菌膜透性等手段,以50 mM苯丙氨酸作为底物高效生产D-PLA。首先,利用高拷贝质粒阿拉伯糖诱导型启动子超表达D-乳酸脱氢酶,基于大肠杆菌BW25113构建重组菌株BW/pRB1s-Dldh,经全细胞催化成功产生D-PLA,其含量为0.35 mM左右,转化率为0.6%;在重组菌中引入苯丙氨酸转氨酶,加速苯丙氨酸到苯丙酮酸的生成,构建重组菌株BW/pRB1s-Dldh-Tyrb,D-PLA的产量达到3.2 mM,转化率为6%;将D-乳酸脱氢酶进行定点突变,构建高酶活D-乳酸脱氢酶重组菌BW/pRB1s-MDldh-Tyrb,D-PLA产量提高到5.5mM,转化率为11%;由于D-乳酸脱氢酶是NADH依赖的氧化还原酶,进而引入谷氨酸脱氢酶建立辅因子NADH再生系统,构建重组菌BW/pRB1s-MDldh-Tyrb-rocG,D-PLA产量上升到13mM左右,转化率达到27%。其次,实验中发现D-乳酸脱氢酶的表达量过高明显抑制了苯丙氨酸转氨酶和谷氨酸脱氢酶的表达,因此通过添加不同个数精氨酸Arg稀有密码子来降低D-乳酸脱氢酶表达水平,结果表明添加4个Arg稀有密码子的重组菌产生17.5 mM的D-PLA,转化率达到35%;随后接着对转化条件进行优化,确定50mMTris-HCl pH8.0的缓冲液、30 OD的菌液浓度、50 mM苯丙氨酸为底物,同时添加5mM α-酮戊二酸的转化体系对D-PLA的合成最有利,最终全细胞转化1 h后D-PLA浓度可达20 mM,转化率为40%,产率为3.4 g/L/h。最后,为了排除转化体系中的产物抑制问题,同时研究大肠杆菌膜透性对D-PLA产生的影响,我们首先在转化体系中加入离子交换树脂,当D-PLA被树脂吸附后,底物苯丙氨酸的浓度基本不变,显示产物抑制现象在全细胞催化生产D-PLA中不存在;随后,利用五种不同浓度的有机溶剂以及表面活性剂提高膜透性,结果表明正己烷的作用效果最明显(1%处理20 min),通过加大苯丙氨酸底物的摄入量,D-PLA最终产量达到30 mM,转化率为60%,产率可达5 g/L/h,该产率为目前所有报道中以苯丙氨酸为底物,全细胞催化生产D-PLA的最高水平。