小豆(Vigna angularis)是我国传统的杂粮作物,因其生育期短、耐瘠薄等特点,在当前农业种植业结构调整中占据重要地位。然而,由豇豆单胞锈菌(Uromyces vignae)引起的小豆锈病,可导致小豆叶片干枯提前落叶,严重影响了小豆的产量和品质。本研究小组前期利用转录组测序技术分析发现,抗锈病小豆品种“QH1”中,接种锈菌后24 h多个WRKY转录因子显著上调表达,因而推测小豆WRKY基因在小豆抗锈病中发挥了重要作用。WRKY转录因子广泛参与植物的抗病过程,调控植物抗病反应及抗病信号通路,如水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)及乙烯(ET)等。因此,为进一步明确小豆WRKY转录因子在抗锈病中的功能,本研究利用小豆全基因组数据,采用生物信息方法,鉴定了小豆基因组中全部WRKY转录因子,并对WRKY家族成员的染色体定位、进化及序列特征等进行了系统分析,同时,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了锈菌侵染不同时期,小豆WRKY转录因子在抗、感不同品种中的表达情况,并以小豆基因组DNA为模板,克隆了VaWRKY33基因全长,初步明确了VaWRKY33在抗锈病中的作用及其与乙烯抗病信号通路的关系。取得的主要研究结果如下:1.采用生物信息学方法分析发现,小豆基因组中共有90个WRKY转录因子,不均匀分布于小豆11条染色体上,最多的为3号染色体有12个,最少的为8号染色体仅有1个,另有18个没有定位到染色体上。对小豆WRKY蛋白序列的分析表明,WRKY结构域高度保守,由WRKYGQK七肽域和锌指结构组成,依据WRKY结构域数量和锌指结构类型,可将小豆WRKY基因家族分为GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ等3个亚家族,分别包含17、61和12个成员。此外,依据进化关系,GroupⅡ亚家族可分为Ⅱ-a(6个)、Ⅱ-b(16个)、Ⅱ-c(21个)、Ⅱ-d(7个)和Ⅱ-e(11个)5个亚组。2.基于课题组前期抗病品种接种锈病病菌后24和48 h的转录组数据,分析了小豆全部WRKY基因的表达情况,检测发现有82个成员不同程度表达,其中16个成员于接种后24 h被显著诱导表达,18个成员于接种后48 h显著上调,另有24个成员在接种后24和48 h均显著上调表达,其余成员则不受锈菌侵染诱导,可能在生长发育中发挥调控作用。为深入了解WRKY基因在小豆抗锈病中的作用,选取其中19个成员,采用qRT-PCR技术分析了候选基因在“QH1”(抗病)和“宝清红”(BQH,感病)中应答锈菌侵染的表达模式,结果表明,在“QH1”中,候选19个成员有5个在侵染前期(接种后12和24 h)显著上调,有6个成员在接菌后48和120 h被显著诱导,另外8个成员则在侵染后期(接种后192 h)显著上调表达;在感病品种“宝清红”中,候选19个成员中有8个在侵染前期(接种后12和24 h)显著上调表达,有3个成员在接菌后48和120 h被显著诱导,另外8个成员则在侵染后期(接种后192 h)显著上调表达,说明小豆WRKY基因家族的不同成员可能在小豆响应锈菌侵染的不同阶段发挥重要的调控作用。3.研究发现,WRKY33及其同源蛋白可能通过乙烯信号通路参与植物的免疫调控,课题组前期研究表明乙烯合成前体1-氨基环丙烷羧酸(ACC)可显著提高小豆对锈病的抗性,为深入了解VaWRKY33是否通过乙烯通路参与小豆抗锈性,本研究以基因组DNA为模板,克隆了该基因全长,测序结果表明VaWRKY33全长2442 bp,包含4个内含子。进一步采用qRT-PCR技术分析了ACC处理对VaWRKY33表达的影响,结果表明,与水处理相比,ACC处理后48-240 h,VaWRKY33表达量均显著高于对照,且处理后60 h表达水平最高,为对照的57.02倍。此外,ACC处理后2 d接种锈菌,接种同时测得VaWRKY33的表达量是对照处理的285.29倍,并呈持续升高的趋势,至接菌后24 h表达量达到峰值。上述结果表明,小豆VaWRKY33基因受ACC诱导显著上调,且在ACC激发并挑战接种后仍持续上调表达,暗示VaWRKY33可能通过乙烯信号通路正调控小豆抗性。