血液循环中的血小板是参与生理性止血的关键细胞,但是过度活化的血小板会引起病理性血栓,导致脑梗,心肌梗死,肺动脉栓塞等危及生命的疾病。血小板活化后,通过细胞骨架重排,钙离子的动员,颗粒内容物分泌,在受损血管壁上形成粘附或血小板间的聚集,并最终形成血栓。血小板活化后的一系列事件都受到磷酯酰肌醇-3激酶(PI3K)通路的调控。PI3Ks能够通过磷酸化磷酯酰肌醇的D3位点,产生胞内第二信使,介导血小板活化。目前,在哺乳动物中,共有8种PI3K,并且根据底物和结构的不同被分为三种亚型。Ⅰ型PI(3)K能以PtdIns(4,5)P2为底物合成PtdIns(3,4,5)P3,广泛参与血小板活化的各个过程,其作用机制已经被研究的比较清楚;Ⅱ型PI(3)K产物底物能够以PtdIns(4)P或PtdIns为底物合成PtdIns(3,4)P2或PtdIns(3)P,目前发现血小板中表达PI3KC2α和PI3KC2β两种亚型,其中PI3KC2α能通过影响血小板细胞膜的完整性调控其剪切应力下在胶原表面的粘附。Ⅲ型PI(3)只有唯一的催化亚基,又被称作Vacuolar protein sorting(VPS)34,通过以PtdIns为底物产生PtdIns(3)P,我们的研究首先报告了血小板中表达的VPS34在血栓止血中的作用,发现血小板特异性缺失该分子后,病理性血栓形成受到抑制,但不影响正常止血,提示其很可能成为抗血栓的潜在防治靶点。初步的机制研究发现VPS34参与调控NADPH氧化酶介导的活性氧簇(ROS)生成,但既往研究提示VPS34还参与mTOR信号、膜泡转运和细胞自噬等重要生物过程,这些过程是否介导了 VPS34敲除所显示的血栓和止血效应改变完全未知。而且经典的血小板活化信号是如何与VPS34分子产生联系,其上游关键分子是什么均为本领域的知识空白。因此本研究以VPS34为出发点,对其上下游调控网络蛋白参与血小板活化和血栓形成的机制进行深入研究,以期为理解血栓与止血的调控机制提供新的理论知识。我们首先验证了前期的表型发现:血小板特异的VPS34敲除小鼠动脉血栓形成时间延长,但是不影响断尾所致的正常生理性止血。同时在低浓度胶原或凝血酶刺激下,VPS34缺失小鼠血小板聚集和颗粒分泌功能明显降低。VPS34缺失的血小板诱导的血块回缩过程明显延迟,但是在固定的纤维蛋白原表面铺展面积不受影响。研究机制上也确认血小板中NADPH氧化酶的组装和活性氧的生成是VPS34调控血小板活化的重要下游机制。因此本研究着重对VPS34相关的mTOR信号和细胞自噬过程进行了分子机制探讨。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,即mTOR)是磷脂酰肌醇激酶相关激酶蛋白质家族成员,是一类非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。mTOR复合物存在两种形式,即mTORC1(mTOR complex 1)及mTORC2。进化上mTOR复合物相对比较保守,主要参与能量与营养相关的多种细胞信号的转导。我们发现,在VPS34敲除的血小板活化过程中,mTOR信号的活化受到了明显抑制,但是mTOR信号抑制剂雷帕霉素和PP242并不能够抑制野生型和VPS34敲除小鼠血小板的活化,也不能抑制血小板活化过程中NADPH氧化酶的组装及ROS的生成。这提示VPS34并不通过mTOR信号介导血小板的快速活化。另外,静息状态下VPS34敲除血小板的自噬发生了明显改变,但是血小板活化过程并没有发现自噬的发生。而文献报道中血小板中自噬关键分子Atg7或Beclin1缺失明显降低血小板活性,因此自噬可能通过其他方式调控血小板的活化。Rubicon是一个能够负向调控VPS34活性的分子,为了进一步研究VPS34相关调控网络在血栓和止血中的作用,我们近期构建了巨核细胞/血小板系特异的Rubicon敲除的小鼠,并进行了初步的表型检测。我们发现与VPS34敲除的数据相反,Rubicon缺失的血小板对胶原的反应性明显增强,在破损血管胶原表面的粘附能力增加,但是值得注意的是其形成的血栓稳定性降低,并且该过程不依赖ROS生成。这些数据提示,Rubicon可能通过与VPS34相互作用调控血栓形成,但同时其有不依赖于ROS的其他下游通路参与稳定血栓的形成。综上所述,我们认为:(1)VPS34主要依赖NOX2的组装和ROS形成调控血栓形成。(2)VPS34所调控的血小板mTOR信号不影响年青状态血小板的快速活化。(3)VPS34调控血小板的基础自噬状态,但自噬过程不影响血小板的反应性。(4)Rubicon缺失小鼠血小板反应性增加,但血栓稳定性降低,该过程存在非ROS依赖的通路。