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目的:ETV4为ETS转录因子家族中PEA3亚家族的成员之一,调控诸多基因表达,参与胚胎肺发育、肿瘤发生发展以及糖尿病等过程。课题组前期结果表明,ETV4作为重要癌基因,其高表达与非小细胞肺癌（Non-small-cell lung cancer,NSCLC）患者的进展及不良预后相关。为进一步揭示ETV4在NSCLC中的调控机制,我们利用m RNA表达谱芯片检测了敲低ETV4对NSCLC细胞基因表达的影响。芯片结果表明,伴随ETV4敲低后下调的基因参与细胞周期进展、DNA复制、WNT、MAPK等重要信号通路的调控过程。本研究主要围绕ETV4对DNA复制关键基因（MCM2、MCM4、MCM5、MCM10和ORC1）表达的调控作用,探讨ETV4-DNA复制在NSCLC细胞增殖与生长中的作用机制。方法:1.细胞培养:含1%青霉素/链霉素的双抗及10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养贴壁生长的A549、H1299、H1703和H358细胞;H358T细胞是对H358细胞用TGF-β长期刺激后转化形成,相对H358细胞ETV4呈高表达。2.细胞转染:利用si RNA瞬时转染H1299、H1703、H358T细胞敲低ETV4表达;利用sh-ETV4慢病毒感染A549细胞,筛选获得稳定敲低ETV4细胞（A549-sh ETV4）;H358细胞中ETV4表达量比较低,用于筛选获得稳定过表达ETV4细胞（H358-ETV4）。3.表达谱芯片检测:H1299、H1703及H358T细胞转染NC-si RNA或si-ETV4后进行芯片检测,由上海康城公司提供服务。4.qRT-PCR方法:检测ETV4-复制相关基因在m RNA水平的表达。5.Western-blot方法:检测ETV4-复制相关基因在蛋白水平的表达。6.染色质结合蛋白分离:分离获得与染色质结合蛋白质,并结合Western-blot方法分析ETV4对染色质结合状态复制相关基因表达的影响。7.报告基因构建与双荧光素酶检测:分析ETV4对复制相关基因启动子区的调控作用。8.染色质免疫共沉淀（Chip）方法:分析ETV4在基因启动子区的结合情况。9.Ed U掺入:检测ETV4对NSCLC细胞复制的影响。10.流式细胞术（FCM）检测:观察ETV4对NSCLC细胞周期分布的影响。11.皮下荷瘤实验:观察过表达ETV4对裸鼠移植瘤形成的影响。12.统计分析:数据以平均±标准差（SD）表示,使用Graph Pad Prism软件对实验数据进行t检验、单因素方差分析（ANOVA）和双因素差分析。SPSS13.0统计软件对实验数据应用卡方检验方法分析。P<0.05时认为有统计学意义。结果:1.表达谱芯片检测敲低ETV4对NSCLC细胞基因表达的影响KEGG生物信息学分析表明,伴随ETV4敲低而显著下调的基因主要参与:细胞周期分布、WNT信号通路、癌症通路、HTLV-I感染、精氨酸和脯氨酸代谢、DNA复制、MAPK信号通路、嘧啶代谢、肝细胞癌和嘌呤代谢途径。其中包括ANAPC11、BUB1、CCND2、CDC20、CDC25B、ESPL1、GADD45A、MCM2、MCM4、MCM5、ORC1、SMAD4和TFDP1在内的13个基因在细胞周期通路中富集,同时MCM2、MCM4、MCM5、ORC1四个基因包括在DNA复制过程。此外,MCM10在敲低ETV4后显著降低（FC=3.27,p=0.012）。因此,本研究中我们主要关注ETV4对5个复制相关基因—MCM2、MCM4、MCM5、MCM10以及ORC1的调控作用。2.ETV4对NSCLC细胞MCM2/4/5/10及ORC1基因表达的影响分别在过表达或敲低ETV4后检测了对NSCLC细胞中上述五个基因表达的影响。q RT-PCR结果表明,与对照组相比,H1703、H1299和H358T细胞si-ETV4转染组中MCM2、MCM4、MCM5、MCM10以及ORC1基因在m RNA水平的表达均显著降低（P<0.05）。反之,H358过表达ETV4（H358-ETV4）细胞中,上述基因在m RNA水平表达显著高于对照组（P<0.05）。此外,Western-blot结果表明,敲低ETV4显著抑制MCM2/4/5/10及ORC1蛋白表达,过表达ETV4后显著增加上述基因在蛋白水平的表达。3.ETV4转录水平调控MCMs和ORC1基因表达为了验证ETV4是否从转录水平调控上述基因表达,我们进一步通过构建报告基因、双荧光素酶检测以及染色质免疫共沉淀方法进行分析。双荧光素酶检测结果表明,与对照组相比,ETV4质粒与Luc-MCMS/ORC1报告基因载体共转染H358或HEK293T细胞后,可显著增加MCM2、MCM4、MCM5、MCM10以及ORC1基因启动子活性（P<0.001）。此外,在H358-ETV4细胞中,利用anti-flag抗体通过Chip-PCR方法检测发现,外源性ETV4（flag标签）与MCMS/ORC1基因启动子区结合。进一步在H1299细胞中,利用anti-ETV4抗体Chip-PCR方法检测结果证实,内源性ETV4可以与MCMs和ORC1的启动子相互作用。以上结果表明,ETV4在转录水平调控MCM2、MCM4、MCM5、MCM10和ORC1基因表达。4.ETV4对NSCLC细胞DNA复制的影响H1703、H1299和H358T细胞中转染si-ETV4,利用Ed U（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine）标记方法检测细胞复制能力。Ed U掺入实验表明,敲低ETV4后Ed U掺入比例显著低于对照组细胞（P<0.05）。而在稳定过表达ETV4的H358-ETV4细胞中,Ed U掺入比例显著增高（P<0.01）。5.ETV4对NSCLC细胞MCMs和ORC1染色质结合蛋白的影响通过核浆分离、染色质结合蛋白提取以及Western-blot方法,在A549-sh ETV4细胞和H358-ETV4细胞中检测ETV4对MCMs和ORC1蛋白染色质结合的影响。结果表明,在稳定敲低ETV4的A549-sh ETV4细胞中,与染色质结合的MCMs和ORC1蛋白表达水平明显降低。反之,稳定过表达ETV4的H358-ETV4细胞中,染色质结合MCMs和ORC1蛋白水平明显高于对照组细胞。6.ETV4对NSCLC细胞周期进展的影响H1703、H1299和H358T细胞中转染si-ETV4后,应用流式细胞术检测敲低ETV4对细胞周期的影响。结果表明,敲低ETV4后,三个NSCLC细胞中G0/G1期的细胞比例显著增加（P<0.05）,提示敲低ETV4后引起细胞G0/G1期阻滞。7.ETV4对裸鼠移植瘤生长的影响在体外检测基础上,进一步通过裸鼠荷瘤实验观察ETV4对肿瘤生长的影响。肿瘤生长曲线表明,H358-ETV4细胞接种组小鼠在12天左右出现肿瘤,并且肿瘤生长速度明显快于对照组（P<0.001）。至21天取材后发现,H358-ETV4组小鼠移植瘤在重量（P<0.001）和体积（P<0.001）上均明显大于对照组小鼠。结论:1.转录因子ETV4可影响细胞周期进展、DNA复制等多个重要信号通路中相关基因的表达,参与非小细胞肺癌的进展过程。2.ETV4转录调控DNA复制体中关键基因—MCM2、MCM4、MCM5、MCM10和ORC1表达,影响MCMs/ORC1染色质结合蛋白水平,从而调控非小细胞肺癌细胞的复制过程。3.ETV4调控细胞复制能力,影响细胞周期进展,是其促进非小细胞肺癌细胞增殖与生长的重要机制之一。