研究背景根据WHO报道,乙型肝炎病毒(HBV)感染在全世界范围内都是棘手问题,据报道全球大约有20亿人既往感染过HBV,而这20亿人群中大约有3.5亿的人是慢性感染者。由于历史等诸多原因,我国是慢性乙型肝炎(CHB)感染者大国,大约有1.2亿人感染过HBV,其中四分之一的人会发展为CHB。在我国CHB是发展为肝癌、肝硬化、肝衰竭最主要的原因。现阶段,有大量的研究表明,积极地进行针对HBV的抗病毒治疗,明显有助于延缓疾病进程,能有效控制向终末期肝病发展,进而显著改善肝病患者的生活质量。阿德福韦酯(adefovir dipivoxil)属核苷(酸)类病毒逆转录酶抑制剂,是一种具有广谱抗病毒活性的药物。在2002年9月美国食品药品监督管理局(FDA)批准阿德福韦酯上市用于治疗慢性乙型肝炎,商品名为Hepsera;2005年4月阿德福韦酯在中国上市,此药最初上市是作为慢性乙肝治疗的二线用药,但随着拉米夫定耐药率的逐渐递增,阿德福韦酯逐渐成为乙肝治疗的一线治疗药物。在2005年和2010年的中国版《慢性乙型肝炎防治指南》均被作为一线抗病毒药物推荐使用。2014年12月的数据显示,因上市时间、价格等原因,在口服核苷类似物抗病毒治疗的CHB患者中,31.7%的患者接受了阿德福韦酯的治疗。最初临床研究中发现,阿德福韦酯低剂量(10mg/d)用于慢性乙型肝炎治疗可出现低磷血症,但并未观察到低磷性骨软化症,批准应用于临床以后,2008年首次报道了低剂量阿德福韦酯致低磷性骨软化症。2015年中国《慢性乙型肝炎防治指南》中明确指出,阿德福韦酯长期应用5年时血清肌酐大于0.5mg/dL的患者比例达到3%,且血清肌酐的升高为可逆性的。长期用药的患者应警惕肾功能不全和低磷性骨病,特别是范可尼综合征的发生。基于此,CFDA要求警惕阿德福韦酯长期使用可能导致低磷血症及骨软化的风险。近年来,国内外已有越来越多的临床资料提示低剂量阿德福韦酯可导致近端肾小管复合重吸收功能障碍,即Fanconi综合征,进一步可导致钙磷代谢障碍,而长期钙磷代谢障碍可导致维生素D抵抗性代谢性骨病,包括成人低磷性骨软化症。由于阿德福韦酯为口服制剂,价格低、易于购买,在我国广大农村地区有着广泛的使用,在长期的使用中阿德福韦酯的不良反应易被忽视和误诊,如不能及时对症处理会引起严重的临床后果,加重乙肝患者的身体和经济负担,对此我们应当加以重视。目前,临床上常用的药物例如抗肿瘤药、抗癫痫药、治疗肾病药、免疫抑制剂、抗生素等对肾毒性的研究资料非常丰富,在提高药物的安全性和疗效方面,给临床提供了很大帮助。临床资料显示,阿德福韦酯所致肾损伤的报道和误诊的报道逐年增多,但我国对阿德福韦酯所致肾损伤的研究比较少,对其肾毒性的研究更是少见。目前国外有报道对阿德福韦酯肾毒性发生的机制可能和hOAT1和MRP-2这两种转运蛋白密切相关,血液中阿德福韦通过hOAT1摄取进入肾小管上皮细胞内,如果蓄积于细胞内的阿德福韦浓度过大,则通过其自身毒性抑制线粒体DNA的合成,直接造成细胞毒性,临床上表现为肾脏近曲小管功能障碍,引起肾毒性。MRP-2可以介导阿德福韦在肾小管细胞的外排,研究发现阿德福韦酯致肾损伤的大鼠模型中发现MRP-2在肾的表达下调。左卡尼汀是一种人体能够自身产生,并在脂肪代谢过程中起到关键作用的物质,它的作用是促进脂肪酸进入线粒体进行氧化分解。左卡尼汀可以将长链脂肪酸转入线粒体内,在线粒体酶的作用下,使脂酰CoA进行β-氧化同时产生ATP,而β-氧化过程产生的乙酰基,左卡尼汀可以将其转运出线粒体,不但减少了乙酰基与游离脂酰CoA结合,而且提高了线粒体中CoA的水平,进而有利于脂肪的进一步分解,可以说左卡尼汀是转运脂肪酸的载体。有学者认为左卡尼汀不但能通过减少溶酶体数量、减少脂肪沉积等来减轻线粒体损伤,还具有维护线粒体外形、增加线粒体单位密度的作用,后来有研究者发现在齐多夫定所引起的线粒体损伤中,当使用左卡尼汀后,可以观察到线粒体损伤明显减轻,还有报道称由于左卡尼汀还是丙酮酸脱氢酶复合体中某些酶复合体的辅助因子,所以其对线粒体结构具有保护作用。临床上有报道左卡尼汀对改善慢性病毒性肝炎患者乏力、纳差等症状有显著效果,数据显示左卡尼汀治疗组患者的总胆固醇水平及血浆ALT较对照组相比明显降低。研究发现抗肿瘤药物顺铂不但可以引起肾小管上皮细胞凋亡导致肾损伤也可引起肾皮质完整线粒体DNA数量显著减少,而应用左卡尼汀后可以有效减轻顺铂导致的肾组织损伤,显著降低顺铂引起的caspase-3、8、9活性的升高,保护肾皮质线粒体DNA数量的减少。本课题旨在探讨阿德福韦酯所致肾损伤的肾毒性机制,我们希望通过建立阿德福韦酯致肾损伤小鼠模型来研究阿德福韦酯对小鼠肾损伤的诱导作用机制,从可以影响到阿德福韦在肾小管聚集浓度的转运和转出这两方面来发掘内在机制。因此我们设计实验探讨了阿德福韦酯对rOAT1和MRP-2表达水平的影响,以验证其是否为阿德福韦酯肾毒性发生因素。从肾小管线粒体功能这方面,我们在动物和细胞实验上以电镜观察阿德福韦酯对线粒体形态的影响,以检测细胞色素C氧化酶和Na+-K+-ATP酶来探讨阿德福韦酯对线粒体功能的影响。同时我们还探讨了 Kim-1能否作为早期肾损伤指标及阿德福韦对HK-2细胞凋亡的影响。左卡尼汀由于其广泛的药理作用,作为肾损伤保护剂已有较多报道,但具体到作为阿德福韦酯致肾损伤的保护剂却鲜有报道,本研究希望通过体内和体外实验来证明左卡尼汀作为可以影响能量代谢的药物是通过何种途径来保护阿德福韦酯致肾损伤对抗其肾毒性的,并为左卡尼汀在临床上的使用提供一定的理论依据。研究方法1.阿德福韦酯致肾损伤动物模型的建立实验分组:小鼠空白组:等量等渗盐水灌胃;小鼠阿德福韦酯灌胃组:(40mg/Kg)每周记录1次各组大鼠饲料消耗、体质量变化情况。实验操作:两组分别于第0d、7d、14d、21d后小鼠采血后处死取肾组织。HE染色法做病理切片观察小鼠肾脏组织结构变化,ELISA检测血清KIM-1的变化,由自动生化分析仪进行检测SCr、BUN水平。2.左卡尼汀对阿德福韦酯致肾损伤小鼠保护作用的研究实验分组:小鼠空白组:等量等渗盐水灌胃;小鼠阿德福韦酯灌胃组:(40mg/Kg)每周记录1次各组大鼠饲料消耗、体质量变化情况;阿德福韦酯+左卡尼汀(2.5g/Kg)组:同时灌胃阿德福韦酯和左卡尼汀。实验操作:各组分别于第21d采血后处死取肾组织,ELISA检测血清KIM-1 水平,透射电镜观察各组肾小管上皮细胞线粒体超微病理结构的改变情况,以试剂盒上的标准步骤检测细胞色素c氧化酶活性、Na+-K+-ATPase活性、western blot法检测阴离子转运蛋白1(rOAT1)和MRP-2表达情况。3.阿德福韦酯致肾小管上皮细胞HK-2细胞损伤及左卡尼汀的保护机制研究实验分组:空白组:不加任何药物;肾小管上皮细胞(HK-2)与阿德福韦酯作用组:只加入阿德福韦酯,浓度梯度为10、20、40、80、160、320(μmol/L)作用时间为24h;阿德福韦酯+左卡尼汀(48.5μmol/L)组:在阿德福韦酯作用组的基础上加入左卡尼汀(48.5 μmol/L)。实验操作:MTT法检测阿德福韦酯对肾小管上皮细胞HK-2细胞增殖的影响;透射电镜观察细胞线粒体的形态;严格按照试剂盒步骤检测细胞色素c氧化酶的活性、Na+-K+-ATPase的活性;流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况、以western bolt法检测阴离子转运蛋白1(hOAT1)、MRP-2的表达情况。结果1.阿德福韦酯灌胃21d后成功建立阿德福韦酯致肾损伤小鼠模型,HE染色法观察病理切片可以看到肾小管发生损伤为研究阿德福韦酯肾毒性打下基础2.阿德福韦酯肾损伤模型小鼠的血液SCr、BUN 水平同正常对照组相比没有发生明显变化,而血清Kim-1的水平明显上升。3.ELISA检测Kim-1结果显示,在小鼠中阿德福韦酯联合左卡尼汀组同阿德福韦酯单用组相比,血清Kim-1 水平显著降低;而联合组同正常对照组相比,血清Kim-1水平没有显著差异。透射电镜观察到阿德福韦酯联合左卡尼汀组肾小管上皮细胞的线粒体呈现中度损伤;阿德福韦酯单用组呈现为重度损伤。4.试剂盒检测细胞色素c氧化酶、Na+-K+-ATPase的活性的结果显示在小鼠中阿德福韦酯单用组均显著低于正常组和联合左卡尼汀组;联合左卡尼汀组同样显著低于正常对照组。5.Western blot结果显示阿德福韦酯单用组同联合左卡尼汀组和对照组相比小鼠肾细胞的rOAT1的表达显著降低,MRP-2的表达显著增高;联合左卡尼汀组同正常对照组相比,rOAT1的表达显著降低,MRP-2的表达显著增高。6.MTT结果显示阿德福韦酯对肾小管上皮细胞HK-2细胞增殖抑制的影响呈剂量依赖性,药物浓度越大,细胞增殖活力越低。但联合左卡尼汀组的细胞增殖活力要显著高于阿德福韦酯单用组,并且在40-80μmol/L时差异最为显著。7.在细胞实验中细胞色素C氧化酶、Na+-K+-ATPase的活性检测和透射电镜结果同小鼠实验结果表现一致,即阿德福韦酯单用组均显著低于正常组和联合左卡尼汀组,联合左卡尼汀组同样显著低于正常对照组;阿德福韦酯联合左卡尼汀组肾小管上皮细胞的线粒体呈现中度损伤;阿德福韦酯单用组呈现为重度损伤。8.流式细胞仪检测结果证明阿德福韦酯可以使HK-2细胞发生凋亡,并且阿德福韦对HK-2细胞凋亡率的影响呈剂量依赖性,剂量越大,凋亡率越高;当联合使用左卡尼汀时可显著降低阿德福韦酯所致凋亡的发生,并且在阿德福韦的剂量越大时,左卡尼汀的这种保护作用越明显。9.Western blot结果显示阿德福韦单用组随着浓度的增加,HK-2细胞中hOAT1的表达不断升高,而联合左卡尼汀组hOAT1的表达在阿德福韦酯各个浓度点均低于单用组,但其表达量的变化趋势是一致的;MRP-2的表达随着阿德福韦酯浓度的增加而不断降低,联合左卡尼汀组在各个阿德福韦酯浓度点要显著高于单用组,两组MRP-2随着阿德福韦酯浓度的增加,其表达量的变化趋势是一致的,均为不断降低。结论1.成功建立阿德福韦酯致小鼠肾损伤模型,明确了在阿德福韦酯作用21d为肾损伤造模成功的时间点。2.血液SCr、BUN水平由于对肾损伤不敏感不能作为肾损伤检测指标,而血清Kim-1 水平的变化可以作为早期肾损伤的检测指标。3.阿德福韦酯通过直接作用于肾小管上皮细胞通过影响细胞色素C氧化酶、Na+-K+-ATPase的活性进而影响肾小管上皮细胞线粒体的形态和功能,对其功能产生阻碍,进而影响到形态发生异常直至凋亡。4.阿德福韦酯的肾毒性和hOAT1、MRP-2的表达相关,阿德福韦酯可以促使肾小管上皮细胞高表达hOAT1、低表达MRP-2,进一步促进了阿德福韦酯在肾小管部位的蓄积而产生毒性作用,严重者可加快肾小管细胞的凋亡。5.阿德福韦酯可以促使肾小管细胞发生凋亡,浓度越高,凋亡率越高。6.左卡尼汀可有效减轻阿德福韦酯所致肾小管损伤,减少肾小管细胞的凋亡,这种保护作用的机制可能是通过影响肾小管上皮细胞hOAT1、MRP-2的表达来减少阿德福韦酯的蓄积,提高细胞色素C氧化酶、Na+-K+-ATPase的活性来保护肾小管上皮细胞的线粒体功能而实现的。