【摘 要】
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目的:明确脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）对人肺泡上皮细胞株A549细胞自噬的影响,初步探讨高迁移率族蛋白B1（High mobility group box-1 protein,HMGB1）和腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-actvated protein kinase kinase,AMPK）信号通路在A549细胞自噬中的调控作用及机制,从细胞层面初步揭示肺泡上皮细胞自噬在L
【基金项目】
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2020年度广西高校中青年教师科研基础能力提升资助项目（2020KY13024）；
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目的:明确脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）对人肺泡上皮细胞株A549细胞自噬的影响,初步探讨高迁移率族蛋白B1（High mobility group box-1 protein,HMGB1）和腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-actvated protein kinase kinase,AMPK）信号通路在A549细胞自噬中的调控作用及机制,从细胞层面初步揭示肺泡上皮细胞自噬在LPS所致急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratorty distress syndrome,ARDS）肺损伤发生发展中的作用,为ARDS的病程及临床治疗提供部分理论依据和实验基础。方法:（1）利用LPS刺激A549细胞,Western blot检测自噬相关分子标志物LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、Beclin-1的表达变化;（2）通过CCK-8实验检测不同剂量的LPS对A549细胞存活率的影响,取最低毒性剂量的LPS诱导A549细胞构建ARDS体外模型;（3）采用流式细胞术检测细胞凋亡和坏死情况,透射电镜观察细胞超微结构,观察有无自噬及细胞死亡形式;（4）用AMPK抑制剂（Compound C）干预,随机分为空白组、LPS组、AMPK抑制剂组和AMPK抑制剂+LPS组。通过Western blot实验和透射电镜检测自噬表达水平,研究AMPK信号通路与LPS诱导的A549细胞自噬及细胞死亡的关系;（5）用si RNA干扰技术抑制HMGB1,随机分为空白组、LPS组、SiHMGB1组、Si-HMGB1+LPS组。通过Western blot实验和透射电镜检测自噬表达水平,研究HMGB1与LPS诱导的A549自噬及细胞死亡的关系。结果:（1）LPS能诱导A549细胞自噬,具有浓度和时间依赖性,LPS处理A549细胞24h的最低毒性剂量为100μg/ml,且细胞的死亡形式为自噬性细胞死亡;（2）AMPK抑制剂干预实验中,与空白组相比,LPS组的P-AMPK和自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ表达水平明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）;与LPS组相比,AMPK抑制剂+LPS组的P-AMPK和自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ明显下降,表达量介于空白组和LPS组之间,差异有统计学意义（P<0.05）,且电镜观察到自噬小体相对于LPS组减少;（3）si RNA干扰技术抑制HMGB1实验中,与空白组相比,LPS组的HMGB1和LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的蛋白表达量明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）,与LPS组相比,Si-HMGB1+LPS组的HMGB1蛋白表达和LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ蛋白表达量明显下降,表达量介于空白组和LPS组之间,差异有统计学意义（P<0.05）,且透射电镜观察到自噬小体相对于LPS组减少。结论:（1）LPS可诱导A549细胞产生自噬;（2）LPS能诱导A549细胞自噬性细胞死亡;（3）LPS通过AMPK信号通路诱导A549细胞自噬和自噬性细胞死亡,抑制AMPK信号通路能抑制A549细胞自噬形成;（4）HMGB1介导LPS诱导的A549细胞自噬和自噬性细胞死亡。
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