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不孕症一直是生殖医学领域中的一项重大挑战,全球患病率约15%。在我国,不孕症的患病率逐年上升,已严重影响育龄期女性身心健康,并易引发一系列医学和社会问题。女性不孕的原因包括排卵障碍、排卵卵母细胞缺陷、异常受精、黄体功能不足等。其中,排卵障碍是不孕症发病的主要原因。卵巢卵泡是女性生殖系统中核心的功能单位。卵母细胞和颗粒细胞是构成卵泡的重要细胞,卵泡的正常发育需要卵母细胞与颗粒细胞间相互作用。传统上根据颗粒细胞在卵泡中的相对位置分为壁层颗粒细胞(mural granulose cells)和卵丘细胞(cumulus cells)。卵丘细胞包绕在卵母细胞周围,与卵母细胞之间具有广泛的交流,在卵泡发育的不同阶段具有不同的作用。在卵泡发育过程中,卵丘细胞中抗苗勒管激素(Anti-mu¨llerian hormone,AMH)表达水平升高,通过降低生长卵泡对卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)的敏感性起到抑制原始卵泡募集、调节卵泡发育的作用。在排卵过程中,卵母细胞分泌生长分化因子9(Growth differentiation factor9,GDF9),通过促进卵丘细胞中前列腺素内过氧化物合酶2(Prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)上调表达起到调节排卵的作用。多囊卵巢综合征(Polycystic ovarian syndrome,PCOS)是一种复杂的内分泌疾病,其特征是无排卵、高雄激素血症和卵巢多囊样改变。有研究表明卵丘细胞的功能失常是导致PCOS患者排卵障碍的重要原因,但其参与的环节及具体调控机制仍不明确。本研究试图探讨正常卵泡中卵丘细胞亚群的分子表达特征及关键基因在排卵过程中的调控机制,为排卵障碍性疾病的诊疗提供潜在的靶点。首先,我们利用单细胞转录组测序(Single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)技术对两名卵巢功能正常女性成熟卵泡来源的卵丘细胞进行分析。结果显示,卵丘细胞可分为三个亚群。整合文献报道的应用重组人绒毛膜促性腺激素(Recombinant human Chorionic Gonadotrophin,rhCG)触发排卵前后的卵丘细胞转录组测序数据,我们发现在rhCG触发排卵过程中上调表达的CD24、前列腺素合成酶(AKR1C1,PLA2G4A,PTGES和PTGS2)和前列腺素转运蛋白(SLCO2A1和ABCC4)在同一个卵丘细胞亚群中高表达(为表述方便,命名为CD24~+GC)。为了进一步研究卵丘细胞中CD24、AKR1C1、PLA2G4A、PTGES、PTGS2、SLCO2A1和ABCC4的表达在体内的调控关系,我们构建了小鼠超数排卵模型。实验结果显示,应用人绒毛膜促性腺激素(human Chorionic Gonadotrophin,hCG)扳机后,卵丘细胞中Cd24a、Pla2g4a,Ptgs2和Slco2a1 mRNA表达水平明显升高。在肿瘤相关研究中,研究者发现CD24通过与表皮生长因子受体(Epithelial growth factor receptor,EGFR)结合,激活EGFR-ERK1/2信号通路促进肿瘤细胞侵袭,并且CD24的高表达与肿瘤细胞的干性相关。也有文献报道EGFR-ERK1/2信号通路是触发排卵的关键因素,能将促黄体生成素(Luteinizing hormone,LH)信号从卵泡周围传递到卵丘-卵母细胞复合物中。因此,我们认为CD24~+GC可能在卵泡排卵过程中有重要作用。我们通过应用免疫共沉淀、细胞免疫荧光化学、放线菌素蛋白翻译抑制等方法,在人卵巢颗粒细胞系(COV434和KGN)中验证CD24与EGFR结合,且CD24蛋白可增加EGFR的稳定性,并激活下游信号通路。通过对正常人卵丘细胞进行体外培养,使用hCG、CD24干扰的慢病毒和MEK的抑制剂,通过应用实时定量PCR法,我们发现CD24-EGFR-ERK1/2信号通路促进卵丘细胞中前列腺素合酶(ARK1C1,PTGS2,PTGES和PLA2G4A)和前列腺素转运蛋白(SLCO2A1和ABCC4)的上调表达。随后,我们在敲低CD24表达的人卵巢颗粒细胞系中,通过应用核质分离、细胞免疫荧光化学、Western Blot等手段,发现上调表达的CD24可以促进EGFR入核。最后,通过应用流式细胞术和实时定量PCR的方法,分析多囊卵巢综合征(Polycystic ovarian syndrome,POCS)患者及卵巢功能正常女性成熟卵泡中卵丘细胞,我们发现PCOS患者来源的卵丘细胞中CD24、前列腺素合成酶(ARK1C1,PTGS2,PTGES和PLA2G4A)和前列腺素转运蛋白(SLCO2A1和ABCC4)的表达低于正常女性来源的卵丘细胞。综上所述,应用单细胞转录组测序技术,我们分析了两名健康女性来源的卵丘细胞,发现卵丘细胞具有一定的异质性且卵丘细胞可根据分子表达特征分为3个亚群。随后,我们讨论了CD24~+GC特征及其标志性分子CD24在排卵中的作用,发现CD24通过激活EGFR-ERK1/2信号通路,并上调前列腺素合酶(ARK1C1,PTGS2,PTGES和PLA2G4A)以及前列腺素转运蛋白(SLCO2A1和ABCC4)表达,参与排卵过程。最后,我们发现,与正常女性相比,PCOS患者卵丘细胞中CD24~+GC所占比例降低,且前列腺素合成酶和前列腺素转运蛋白的mRNA表达量降低。可见,CD24及其调控的信号通路参与了正常的排卵过程。卵丘细胞中CD24~+GC的比例有可能成为排卵障碍性疾病的诊断指标,CD24-EGFR-ERK1/2信号通路可作为排卵障碍性疾病的潜在干预靶点。