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显微观察清楚显示粉红螺旋聚孢霉(Clonastachys rosea)两种类型的产孢结构,即帚状分生孢子梗和轮枝状分生孢子梗。将两种类型产孢结构上的分生孢子做单孢子分离,并对各单孢株作培养特征观察和形态学观察;同时通过多次传代确定其多型性的遗传稳定性。结果表明,两种类型的产孢结构是该种特有的形态学特征,可以与其它相似种区别,多型性产孢结构能稳定遗传。
分别研究不同培养温度、pH、碳源、氮源、光照、真菌抑制剂对粉红螺旋聚孢霉分生孢子形态、菌丝生长以及对植物病原真菌、线虫固定能力等的生物学特性的影响。结果表明,不同培养条件可以不同程度地影响粉红螺旋聚孢霉生长或孢子的种类。当培养基pH2.5时,粉红螺旋聚孢霉能形成少量的分生孢子梗,所形成的分生孢子梗均为轮枝状结构,轮枝状分枝与分生孢子形态大小正常;培养基pH>3.0时,pH值的高低只影响菌株的生长速度,而不再影响产孢结构的类型,即均可形成两种产孢结构,形态大小正常。不同条件的温度、碳源、氮源及光照只影响该菌的生长速度和产孢结构数量,而不影响产孢结构的类型。加有真菌抑制剂TBZ(Thiabendazole)的平板上只形成轮枝状分生孢子梗,但是这种改变为可逆的;当转接回普通PDA平板后又可以产生两种形态分生孢子梗。测定各原始菌株及对立枯丝核菌和线虫的固定能力,表明只形成轮枝状分生孢子梗的时期的侵染率远远低于混合时期菌株的固定率。
采用抑制性消减杂交技术(Suppression substractive hybridization)以只产生轮枝状分生孢子梗和产生轮枝、帚状两种分生孢子梗互为样品与对照进行分析,在所构建的两个消减杂交文库中随机选取克隆并进行测序,得到与轮枝状分生孢子梗和帚状分生孢子梗形成相关的候选基因。对测序结果进行比对分析后,选取其中四个基因进行realtime PCR验证。realtime PCR的结果显示,在只产生轮枝状分生孢子梗时期为样品的文库中选择的两个基因其表达方式确实为轮枝高表达;而有从另一个杂交方向文库中选择的两个基因在轮枝、帚状分生孢子梗混合时期的表达水平远远高于只产生轮枝状分生孢子梗时期。
论文的创新性主要体现在:
(1) 粉红螺旋聚孢霉一方面可作为防治植物病害的生防因子加以研究,另一方面可作为典型重寄生机制的模型加以研究,它的双重功能比较其余单一功能的生防菌具有明显优势,因此研究它对阐明生物间的寄生现象及信号传递有重要的意义。
(2)对粉红螺旋聚孢霉多型性的形态研究已经有很长的历史,但是对其分子机制还未见报道,本实验首次采用抑制行消减杂交技术对粉红螺旋聚孢霉不同生长时期的基因差异经行了比较,各获得约四百个克隆,分别选取67和65个克隆进行测序并分析。并采real-time pcr技术对粉红螺旋聚孢霉不同生长时期通过SSH筛选出的差异表达的四个片段进行了验证,证明这些片段在其形态不同的生长时期确实存在差异表达。