本实验研究过氧化物酶体脂肪酸β-氧化在2-型糖尿病脂代谢紊乱中所起的作用，分析2-型糖尿病过氧化物酶体脂肪酸β-氧化及脂酰辅酶A氧化酶活性的改变，并检测脂酰辅酶A氧化酶的表达量。对过氧化物酶体脂肪酸β-氧化与T2DM高FFA血症发以及在T2DM脂代谢紊乱中所起的作用进行初步探讨。 研究方法：病历的收集：选取我市各大医院2004年2月～2005年1月根据1999世界卫生组织(WHO)糖尿病诊断标准诊断和分型的2型糖尿病患者112例，其中男性59例，女性53例。按照年龄分40岁以下组、40～60岁组、60岁以上组。病程1～13年，口服降糖药物治疗。全部病例排除肥胖、高血压病、冠心病、动脉粥样硬化、肝肾功能异常、合并严重感染、甲状腺疾病等并发症，排除一月内用过胰岛素、胰岛素增敏剂、降血脂药物者。正常对照122例(男/女为60/62)为同期健康体检者，除外肥胖、糖尿病、高血压病、冠心病等。 常规指标测定：各组成员全部测量空腹时身高、体重，计算体重指数(BMI)。进行白细胞记数，用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FBG)。酶比色法测定血清总胆固醇(TC)、甘油磷酸氧化酶法测定甘油三酯(TG)、双试剂直接法测定高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)。 细胞匀浆液的制备：用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞。向提取的单个核细胞中加入匀浆缓冲液匀浆，离心取上清液用于蛋白质含量、过氧化物酶体脂肪酸β-氧化及脂酰CoA氧化酶活性的测定。 匀浆液蛋白含量的测定：用Lowry改良法测定样品蛋白含量，以牛血清白蛋白为标准绘制蛋白标准曲线、计算样品蛋白浓度。@2测定过氧化物酶体脂肪酸β-氧化：依据参考文献，简述如下，反应体系为1ml，包括50mmol/LPH8.2磷酸盐缓冲液，0.15mg/mlBSA，0.01％TritonX-1∞，0.5mmol/LNAD，0.2mmol/LCoA，1mmol/LDTT以及50mmol/L软脂酰CoA。反应温度37℃，在1mmol/LKCN(抑制线粒体脂肪酸β-氧化)存在的条件下，测定由于软脂酰CoA氧化，NAD被还原而引起的340nm处吸光度的增加速率，来反映过氧化物酶体脂肪酸β-氧化的活性，并计算脂肪酸β-氧化活性单位用U/mg蛋白表示)。 脂酰CoA氧化酶活性测定：采用荧光分光光度法，测定过氧化物酶体中软脂酰CoA氧化所生成的H2O2的量来反映脂酰CoA氧化酶活性。H2O2可催化高荧光物质7-羟基-6-甲氧基香豆素(Scopoletin)氧化为非荧光物质，以荧光强度的变化来反映H2O2的生成量。反应混合物体积为0.5ml，包括Tris-HCL(60mM)，PH8.3，软脂酰CoA(35mM)，FAD(50mM)，NAD(200μM)，CoA(170μM)，scopletin(1μM)，过氧化物酶(3units)，BSA(0.6mg)，TritonX-100(0.01％)。37℃避光反应20分钟，并不断摇动。加入2mlof0.1M硼酸缓冲液(PH10.)终止反应。室温测定，激发波长395nm，发射波长470nm。根据Scopoletin荧光强度变化与H2O2量关系绘制的标准曲线、测定样品脂酰辅酶A氧化酶的活性并计算活性单位。 RT-PCR检测ACOX基因表达：用碧云天公司提供的RNA提取试剂盒提取全血中的总RNA，在260and280处测定RNA的纯度和浓度。用反转录试剂盒37℃反转录4小时。PCR扩增转录产物，引物序列如下：引物1：5’-TCACCGGATTAACGAAGG-3’，引物2：5-GCTGCACGGAGTTTATATGC-3；反应体系为50μl，包括10XPCR反应缓冲液5μl，dNTPs(10mMeach)1μl，反转录产物1ul，TaqDNA聚合酶(5U/μl)0.4ul，引物各1μl，ddH2O41.6ul。反应程序为预变性5min，三温循环95℃50s、55℃50s、72℃60s，35次，末延伸72℃5min。琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。 研究结果：临床和血清生化指标：各组临床指标T2DM组与对照组(control)相比：40岁以下年龄组WBC无统计学意义，P＞0.05；BMI无统计学意义，P＞0.05；FBG增加了96％，有统计学意义，P＜0.01；血清TC增加了31％，有统计学意义，P＜0.05；TG增加了57％，有统计学意义，P＜0.05；HDL降低了39％，有统计学意义，P＜0.05；LDL增加了43％，有统计学意义，P＜0.05。40-60岁年龄组WBC无统计学意义，P＞0.05；BMI无统计学意义，P＞0.05；FBG增加了85％，有统计学意义，P＜0.01；血清TC增加了25％，有统计学意义，P＜0.05；TG增加了50％，有统计学意义，P＜0.05；HDL降低了27％，有统计学意义，P＜0.05；LDL增加了47％，有统计学意义，P＜0.05。60岁以上年龄组WBC无统计学意义，P＞0.05；BMI无统计学意义，P＞0.05；FBG增加了86％，有统计学意义，P＜0.01；血清TC增加了34％，有统计学意义，P＜0.05；TG增加了60％，有统计学意义，P＜0.05；HDL降低了26％，有统计学意义，P＜0.05；LDL增加了45％，有统计学意义，P＜0.05。 T2DM各组间及正常对照各组间比较均无统计学意义，P＞0.05。@2过氧化物酶体脂肪酸β-氧化活性：T2DM组与对照组相比，40岁以下年龄组过氧化物酶体脂肪酸β-氧化活性增加了42％，有统计学意义，P＜0.05；40-60岁年龄组过氧化物酶体脂肪酸β-氧化活性增加了32％，有统计学意义，P＜0.05；60岁以上年龄组过氧化物酶体脂肪酸β-氧化活性增加了35％，有统计学意义，P＜0.05。 T2DM各组间及正常对照各组间比较均无统计学意义，P＞0.05。 过氧化物酶体脂酰CoA氧化酶活性：T2DM组与对照组相比，40岁以下年龄组脂酰CoA氧化酶活性增加了36％，有统计学意义，P＜0.05；40-60岁年龄组脂酰CoA氧化酶活性增加了37％，有统计学意义，P＜0.05；60岁以上年龄组脂酰CoA氧化酶活性增加了34％，有统计学意义显著，P＜0.05。 T2DM各组间及正常对照各组间比较均无统计学意义，P＞0.05。 脂酰CoA氧化酶的mRNA表达：与对照组相比，各T2DM年龄组过氧化物酶体脂酰CoA氧化酶活性的mRNA表达量均明显增高，而T2DM各组间及正常对照各组间比较均无统计学意义。 研究结论：糖尿病状态下血中随脂肪动员增强而产生的大量FFA及其代谢产物，过氧化物酶体脂肪酸β-氧化增强，过氧化物酶体脂肪酸β-氧化的限速酶脂酰CoA氧化酶活性也增强以满足大量脂肪酸分解代谢的需要。提示过氧化物酶体脂肪酸β-氧化与糖尿病脂代谢紊乱有一定的关系，为T2DM发病机理提供了理论依据。