论文部分内容阅读
本实验研究过氧化物酶体脂肪酸β-氧化在2-型糖尿病脂代谢紊乱中所起的作用,分析2-型糖尿病过氧化物酶体脂肪酸β-氧化及脂酰辅酶A氧化酶活性的改变,并检测脂酰辅酶A氧化酶的表达量。对过氧化物酶体脂肪酸β-氧化与T2DM高FFA血症发以及在T2DM脂代谢紊乱中所起的作用进行初步探讨。
研究方法:病历的收集:选取我市各大医院2004年2月~2005年1月根据1999世界卫生组织(WHO)糖尿病诊断标准诊断和分型的2型糖尿病患者112例,其中男性59例,女性53例。按照年龄分40岁以下组、40~60岁组、60岁以上组。病程1~13年,口服降糖药物治疗。全部病例排除肥胖、高血压病、冠心病、动脉粥样硬化、肝肾功能异常、合并严重感染、甲状腺疾病等并发症,排除一月内用过胰岛素、胰岛素增敏剂、降血脂药物者。正常对照122例(男/女为60/62)为同期健康体检者,除外肥胖、糖尿病、高血压病、冠心病等。
常规指标测定:各组成员全部测量空腹时身高、体重,计算体重指数(BMI)。进行白细胞记数,用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FBG)。酶比色法测定血清总胆固醇(TC)、甘油磷酸氧化酶法测定甘油三酯(TG)、双试剂直接法测定高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)。
细胞匀浆液的制备:用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞。向提取的单个核细胞中加入匀浆缓冲液匀浆,离心取上清液用于蛋白质含量、过氧化物酶体脂肪酸β-氧化及脂酰CoA氧化酶活性的测定。
匀浆液蛋白含量的测定:用Lowry改良法测定样品蛋白含量,以牛血清白蛋白为标准绘制蛋白标准曲线、计算样品蛋白浓度。@2测定过氧化物酶体脂肪酸β-氧化:依据参考文献,简述如下,反应体系为1ml,包括50mmol/LPH8.2磷酸盐缓冲液,0.15mg/mlBSA,0.01%TritonX-1∞,0.5mmol/LNAD,0.2mmol/LCoA,1mmol/LDTT以及50mmol/L软脂酰CoA。反应温度37℃,在1mmol/LKCN(抑制线粒体脂肪酸β-氧化)存在的条件下,测定由于软脂酰CoA氧化,NAD被还原而引起的340nm处吸光度的增加速率,来反映过氧化物酶体脂肪酸β-氧化的活性,并计算脂肪酸β-氧化活性单位用U/mg蛋白表示)。
脂酰CoA氧化酶活性测定:采用荧光分光光度法,测定过氧化物酶体中软脂酰CoA氧化所生成的H2O2的量来反映脂酰CoA氧化酶活性。H2O2可催化高荧光物质7-羟基-6-甲氧基香豆素(Scopoletin)氧化为非荧光物质,以荧光强度的变化来反映H2O2的生成量。反应混合物体积为0.5ml,包括Tris-HCL(60mM),PH8.3,软脂酰CoA(35mM),FAD(50mM),NAD(200μM),CoA(170μM),scopletin(1μM),过氧化物酶(3units),BSA(0.6mg),TritonX-100(0.01%)。37℃避光反应20分钟,并不断摇动。加入2mlof0.1M硼酸缓冲液(PH10.)终止反应。室温测定,激发波长395nm,发射波长470nm。根据Scopoletin荧光强度变化与H2O2量关系绘制的标准曲线、测定样品脂酰辅酶A氧化酶的活性并计算活性单位。
RT-PCR检测ACOX基因表达:用碧云天公司提供的RNA提取试剂盒提取全血中的总RNA,在260and280处测定RNA的纯度和浓度。用反转录试剂盒37℃反转录4小时。PCR扩增转录产物,引物序列如下:引物1:5’-TCACCGGATTAACGAAGG-3’,引物2:5-GCTGCACGGAGTTTATATGC-3;反应体系为50μl,包括10XPCR反应缓冲液5μl,dNTPs(10mMeach)1μl,反转录产物1ul,TaqDNA聚合酶(5U/μl)0.4ul,引物各1μl,ddH2O41.6ul。反应程序为预变性5min,三温循环95℃50s、55℃50s、72℃60s,35次,末延伸72℃5min。琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。
研究结果:临床和血清生化指标:各组临床指标T2DM组与对照组(control)相比:40岁以下年龄组WBC无统计学意义,P>0.05;BMI无统计学意义,P>0.05;FBG增加了96%,有统计学意义,P<0.01;血清TC增加了31%,有统计学意义,P<0.05;TG增加了57%,有统计学意义,P<0.05;HDL降低了39%,有统计学意义,P<0.05;LDL增加了43%,有统计学意义,P<0.05。40-60岁年龄组WBC无统计学意义,P>0.05;BMI无统计学意义,P>0.05;FBG增加了85%,有统计学意义,P<0.01;血清TC增加了25%,有统计学意义,P<0.05;TG增加了50%,有统计学意义,P<0.05;HDL降低了27%,有统计学意义,P<0.05;LDL增加了47%,有统计学意义,P<0.05。60岁以上年龄组WBC无统计学意义,P>0.05;BMI无统计学意义,P>0.05;FBG增加了86%,有统计学意义,P<0.01;血清TC增加了34%,有统计学意义,P<0.05;TG增加了60%,有统计学意义,P<0.05;HDL降低了26%,有统计学意义,P<0.05;LDL增加了45%,有统计学意义,P<0.05。
T2DM各组间及正常对照各组间比较均无统计学意义,P>0.05。@2过氧化物酶体脂肪酸β-氧化活性:T2DM组与对照组相比,40岁以下年龄组过氧化物酶体脂肪酸β-氧化活性增加了42%,有统计学意义,P<0.05;40-60岁年龄组过氧化物酶体脂肪酸β-氧化活性增加了32%,有统计学意义,P<0.05;60岁以上年龄组过氧化物酶体脂肪酸β-氧化活性增加了35%,有统计学意义,P<0.05。
T2DM各组间及正常对照各组间比较均无统计学意义,P>0.05。
过氧化物酶体脂酰CoA氧化酶活性:T2DM组与对照组相比,40岁以下年龄组脂酰CoA氧化酶活性增加了36%,有统计学意义,P<0.05;40-60岁年龄组脂酰CoA氧化酶活性增加了37%,有统计学意义,P<0.05;60岁以上年龄组脂酰CoA氧化酶活性增加了34%,有统计学意义显著,P<0.05。
T2DM各组间及正常对照各组间比较均无统计学意义,P>0.05。
脂酰CoA氧化酶的mRNA表达:与对照组相比,各T2DM年龄组过氧化物酶体脂酰CoA氧化酶活性的mRNA表达量均明显增高,而T2DM各组间及正常对照各组间比较均无统计学意义。
研究结论:糖尿病状态下血中随脂肪动员增强而产生的大量FFA及其代谢产物,过氧化物酶体脂肪酸β-氧化增强,过氧化物酶体脂肪酸β-氧化的限速酶脂酰CoA氧化酶活性也增强以满足大量脂肪酸分解代谢的需要。提示过氧化物酶体脂肪酸β-氧化与糖尿病脂代谢紊乱有一定的关系,为T2DM发病机理提供了理论依据。