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研究背景：随着世界老龄人口的日益增多,阿尔茨海默病等中枢神经系统退行性疾病的防治显得日益重要。但阿尔茨海默病发病机制复杂,病因至今尚不明确。目前提出的有淀粉样蛋白级联、tau蛋白异常磷酸化、胆碱能神经凋亡、自由基损伤、兴奋性毒性等学说。而自1984年Khachaturian提出钙平衡失调学说后,不断得到证实和发展,已逐渐为人们所认同。细胞内Ca2+超载是急性和慢性神经退行性病变致细胞凋亡或死亡的“最后共同通路”。其中,IP3受体介导的细胞内钙释放可启动线粒体途径或激活Ca2+敏感酶等,引起细胞凋亡。因而,调节IP3受体介导的Ca2+释放有可能成为阿尔茨海默病的治疗靶点。肝素(UFH)是IP3受体的竞争性拮抗剂,但由于分子量大不能穿过细胞膜,只能通过显微注射进入细胞内,所以其应用受到极大限制。超低分子量肝素(ULMWH)是经UFH降解而成的寡糖片段,平均分子量2.2kDa,具有分子量小、分布区间集中、生物利用度高、抗凝活性低等优点,因而阐明ULMWH对神经细胞的作用及其分子机制,具有重要的理论意义和实用价值,将为AD的防治提供新型有效的措施。研究目的：本研究观察ULMWH对Aβ25-35诱导的神经细胞凋亡的作用及对诱导物刺激细胞内Ca2+升高的影响,以期阐明ULMWH的作用机制,为临床应用提供理论依据。实验方法：1.Aβ25-35诱导细胞损伤及其纤维形成的鉴定(1)光学显微镜下观察原代培养大鼠神经细胞的形态,采用MTT法检测不同浓度的Aβ25-35(10、25、35、50μM)作用24h对神经细胞活力的影响,确定Aβ25-35诱导细胞损伤的最佳浓度。(2)最佳损伤浓度的Aβ25-35在37℃孵育7天后,用透射电镜或荧光指示剂硫磺素T考察Aβ25-35的纤维形成。2.ULMWH对Aβ25-35诱导神经细胞凋亡的影响取培养好的神经细胞,加入2、10、50μg/ml的ULMWH预孵育2h,然后加入最佳浓度的Aβ25-35继续孵育24h,对以下指标进行测定。(1)采用MTT法检测细胞活力,LDH测定试剂盒测定细胞LDH漏出率,考察ULMWH对Aβ25-35所致细胞损伤的影响。(2)Annexin V/PI-FITC双染色法定量测定细胞凋亡百分率；Hoechst 33258荧光染色法观察ULMWH对凋亡细胞形态的影响；TNNEL法检测凋亡细胞形态及计算凋亡指数,评价ULMWH对Aβ25-35诱导细胞凋亡的所用。(3)以Western blotting法检测神经细胞内Bcl-2和Capase-3蛋白表达变化；以荧光指示剂Fura-2/AM测定细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的变化,初步探讨ULMWH抑制Aβ25-35诱导神经细胞凋亡的分子机制。3.ULMWH对神经细胞内钙浓度的影响(1)取培养7d的神经细胞,加入浓度分别为1、10、100μg/ml的ULMWH,以Fura-2/AM测定细胞内钙离子浓度的变化,分别考察在有钙和无钙条件下ULMWH对静息神经细胞[Ca2+]i的影响。(2)取培养7d的神经细胞,加入浓度分别为1、10、100μg/ml的ULMWH预孵育5min,然后加入终浓度为20mM的KCl或500μM的谷氨酸以刺激外钙内流,Fura-2/AM测定细胞内钙离子浓度的变化,考察ULMWH对KCl或谷氨酸诱导神经细胞外钙内流的影响。(3)取培养7d的神经细胞,首先加入10μg/ml的皂角苷处理细胞,提高细胞膜对加入IP3的通透性。分别加入浓度为1、10、100μg/ml的ULMWH预孵育5min,然后加入终浓度为10μM的IP3刺激细胞内钙释放,Fura-2/AM测定细胞内钙离子浓度的变化,考察ULMWH对IP3诱导神经细胞内钙释放的影响。(4)分离神经细胞线粒体和内质网,加入浓度分别为1、10、100μg/ml的ULMWH预孵育5min,再加入终浓度为10μM的IP3刺激内质网或线粒体内钙释放,考察ULMWH对IP3诱导神经细胞线粒体或内质网Ca2+释放的影响。实验结果：1.Aβ25-35诱导细胞损伤及其纤维形成的鉴定(1)神经细胞培养至7d时胞体增大,突起进一步增多并逐渐成网,细胞间出现互相迁移靠拢,部分神经元聚集成团,可见密集的神经元细胞网络,未见明显的胶质细胞,可用于实验。(2)细胞存活率随Aβ25-35浓度升高而降低,但由于50μM Aβ25-35处理组与对照组相比细胞存活率仅为43.17%,光镜下多数细胞已变圆。而35μMAβ25-35处理组与对照组相比细胞存活率为60.66%,结合光镜下细胞形态,选用35μM作为Aβ25-35诱导神经细胞损伤的作用浓度。(3)透射电镜观察：对照组中35μM Aβ25-35孵育30 min后,主要以无定形结构存在,呈絮状,未见纤维结构形成。老化处理组中35μM Aβ25-35孵育7d后,以淀粉样纤维结构为主,纤维相互交织呈网状结构,纵横交错,呈针状或晶状聚集,无分枝。(4)Th-T荧光分析：老化组荧光强度平均值为82.79,与对照组(10.88)相比有显著性差异(P<0.01),间接反映Aβ25-35纤维化的程度。2.ULMWH对Aβ25-35诱导神经细胞凋亡的影响(1)以35μM Aβ25-35处理后,细胞活力显著降低(P<0.01),LDH漏出率显著升高(P<0.01),与2、10、50μg/ml ULMWH共同孵育,能够升高神经细胞的存活力,降低LDH漏出率,结果具有显著性差异(P<0.01),确定ULMWH对Aβ25-35诱导的神经细胞损伤具有保护作用。(2)流式细胞术检测结果显示,Aβ25-35处理后细胞凋亡率显著增加(P<0.01),而不同浓度的ULMWH处理后,细胞凋亡率呈现浓度依赖性降低；Hoechst 33258荧光染色结果发现,Aβ25-35可以促使神经细胞凋亡,荧光显微镜下细胞核内可见浓染致密的颗粒状荧光,呈现出凋亡细胞典型的核固缩、核碎裂,而ULMWH能够改善细胞凋亡形态,减少凋亡细胞的数量；TUNEL实验发现,对照组的细胞核呈现均一的蓝染,无明显的凋亡细胞,Aβ25-35处理组细胞核呈棕褐色,核固缩,呈现出明显的TUNEL阳性改变,ULMWH处理组细胞核棕褐色染色的细胞明显减少。证明ULMWH对Aβ25-35诱导的神经细胞凋亡具有抑制作用。(3)Aβ25-35处理神经细胞24h,Caspase-3蛋白表达明显升高,Bcl-2蛋白表达降低,而ULMWH能够显著降低Caspase-3表达,升高Bcl-2表达,结果具有显著性差异。(4)与对照组相比,Aβ25-35能显著提高细胞内游离钙水平,而不同浓度的ULMWH能够显著抑制细胞内钙浓度的升高,结果具有显著性差异(P<0.01)3.ULMWH对神经细胞内钙浓度的影响(1)1、10、100μg/ml的ULMWH能使含钙和不含钙条件下的静息神经细胞内[Ca2+]i有所降低,结果具有显著性差异(P<0.01)(2)20mM KCl或500μM谷氨酸可使细胞内钙离子浓度明显升高(P<0.01),而预孵不同浓度的ULMWH对KC1引起的[Ca2+]i升高并无明显抑制作用,但对谷氨酸引起的[Ca2+]i升高有一定的抑制作用。(3)IP3能显著提高细胞内钙离子浓度(P<0.01),预孵不同浓度的ULMWH能够显著抑制IP3引起的[Ca2+]i］升高,具有显著性差异(P<0.01)(4)IP3能使线粒体和内质网释放到外液中的Ca2+浓度升高(P<0.01)以不同浓度的ULMWH预孵5min后,再应用IP3刺激,能显著抑制IP3诱导的内钙释放,具有显著性差异(P<0.01)。结论：(1)ULMWH可显著提高细胞生存率,抑制细胞内LDH释放,对Aβ25-35诱导的神经细胞损伤具有保护作用。(2)ULMWH能通过升高Bcl-2表达,降低Caspase-3表达,抑制细胞内钙离子浓度升高,从而改善细胞形态,降低细胞凋亡率,抑制Aβ25-35诱导的细胞凋亡作用。(3)ULMWH对KCl诱导的钙内流无明显影响,对谷氨酸诱导的[Ca2+]i升高有部分抑制作用。(4)ULMWH能够在亚细胞水平上显著降低IP3诱导的[Ca2+]i升高。