清胰汤治疗小鼠急性胰腺炎的代谢组学与分子机制初步研究

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目的:1、利用HPLC方法建立清胰汤内控质量标准;2、基于代谢组学与RT-PCR技术,探究清胰汤缓解小鼠急性胰腺炎可能的分子机制。方法:(1)选取源自清胰汤中5种药材的10个有效成分,利用HPLC方法进行定量分析,对方法的准确性、专属性、线性、精密度、重复性、稳定性进行验证。(2)研究不同造模剂剂量的成模能力以建立能够模拟临床实际的小鼠急性胰腺炎模型。以胰腺、肺、小肠组织的病理变化情况和血清淀粉酶(Amylase,AMS)、脂肪酶(Lipase,Lip)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)和白介素-6(interleukin 6,IL-6)等生化和炎症指标为主要考察对象,研究清胰汤对小鼠急性胰腺炎的治疗作用。(3)采集各组小鼠血清样本,采用UPLC-Q-TOF MS技术进行测定,数据初步处理后采用PCA和OPLS-DA方法寻找差异性代谢产物信号,然后用HMDB(http://www.hmdb.ca/)进行检索得到潜在生物标志物,结合二级质谱数据和文献分析,确定差异代谢产物。最后利用MetaboAnalyst(https://www.metaboanalyst.ca/)和KEGG(https://www.genome.jp/kegg/)进行通路分析。(4)通过RT-PCR技术检测胰腺组织中TNF-α、COX-2、NOX2和MMP-9基因表达情况,研究清胰汤对急性胰腺炎模型小鼠胰腺组织炎症相关基因表达的影响。结果:(1)清胰汤中10个有效成分可实现完全分离,在一定的浓度范围内线性关系良好,方法的精密度、稳定性、重复性符合《中华人民共和国药典》2015年版中药品质量标准分析方法验证指导原则(四部9101)的要求。试检3批清胰汤样品,发现其中芍药苷、胡黄连苷II、胡黄连苷I、黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、大黄酸、柴胡皂苷B2、大黄素、大黄酚的含量范围分别为251.22276.12、649.52694.33、242.74306.69、935.55979.03、33.8635.97、8.319.65、15.1724.23、6.749.74、4.167.47、8.399.27 mg。(2)最终确定采用80μg·kg-1雨蛙素和12 mg·kg-1脂多糖进行造模。模型组较空白组小鼠血清AMS、Lip、IL-6水平明显升高,SOD水平明显降低,具有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比,清胰汤组胰腺、肺、小肠组织病理切片明显好转,趋于正常;血清AMS、Lip、IL-6水平均明显降低,SOD水平均明显升高,说明清胰汤对小鼠急性胰腺炎具有一定治疗作用。(3)与正常小鼠相比,雨蛙素联合脂多糖诱导的急性胰腺炎小鼠中有28个潜在代谢产物发生了显著性变化,主要涉及亚油酸代谢(Linoleic acid metabolism)、牛磺酸与次牛磺酸代谢(Taurine and hypotaurine metabolism)和花生四烯酸代谢(Arachidonic acid metabolism)等代谢通路。给予清胰汤后,有17个代谢产物均发生不同程度的回调。通过代谢通路分析,发现清胰汤可能通过干预亚油酸代谢、牛磺酸与次牛磺酸代谢和花生四烯酸代谢通路发挥缓解小鼠急性胰腺炎的作用。(4)与空白组相比,模型组小鼠胰腺组织中TNF-α、COX-2、NOX2、MMP-9基因mRNA相对表达量显著升高。给予清胰汤治疗后,上述指标呈现不同程度回调,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:我们成功建立了清胰汤中10个指标成分的含量测定方法,为确保药物的有效性提供了实验数据保障。清胰汤可以缓解雨蛙素联合脂多糖诱导的小鼠急性胰腺炎。血清代谢组学研究显示其主要通过调节亚油酸、牛磺酸与次牛磺酸以及花生四烯酸代谢通路发挥作用。RT-PCR研究显示药物可以抑制小鼠胰腺组织炎症相关基因TNF-α、COX-2、NOX2、MMP-9的表达。
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