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结合文献调研和氨基酸序列比对结果,应用over-lap PCR技术对金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)的二硫环内部102-106位氨基酸残基,分别以WWH、WWT和WWP进行替换,构建成三株突变蛋白(ST-1、ST-2和ST-3),通过体内和体外生物学活性检测发现:与野生型SEC2相比,三株突变蛋白的免疫刺激活性和肿瘤抑制活性都显著增强,同时伴随着家兔体内致热毒性的不同程度增强。其中ST-1具有相对较低的致热毒性。研究结果说明102-106位氨基酸残基是决定SEC2超抗原活性的重要结构功能区域。
结合本实验室前人研究结果,对ST-1蛋白进一步结构改造,增加20、22、118、122氨基酸位点突变,构建组合突变蛋白ST-4,研究结果显示:组合突变蛋白ST-4的体外刺激T细胞增殖活性和抑瘤活性显著高于野生型SEC2和ST-1;ELISA分析结果显示,ST-4体外刺激T细胞分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ的能力较野生型SEC2也有显著的增强;但同时其体内致热毒性也有明显的增强。这说明在SEC2分子中二硫环内结构域相对于其他结构域对SEC2超抗原活性的影响具有一定独立性,在不同结构域之间进行组合突变对其超抗原活性的影响具有叠加效应。
分析了SEC2中Tyr26对其超抗原活性的影响。应用定点突变技术对Tyr26分别进行了同源替换和无意义替换,构建获得突变蛋白SEC2(Y26V)和SEC2(Y26A),其体内外超抗原活性与野生型SEC2无显著差异,但两者对抗野生型SEC2抗体的结合力都显著降低。说明Tyr26尽管处于SEC2的TCR结合区,但并不是决定其超抗原活性的关键位点,却可能是SEC2的抗原决定簇中的重要氨基酸残基,影响其抗原表位。