论文部分内容阅读
L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartateα-decarboxylase，PanD EC4.1.1.11)是微生物泛酸（由泛解酸和β-丙氨酸组成）生物合成途径中的关键酶，由panD基因编码，以丙酮酰基为催化活性中心，具有严格的底物特异性，可以催化L-天冬氨酸脱去α羧基生成β-丙氨酸。β-丙氨酸的合成途径只存在于微生物和植物细胞中，因此以L-天冬氨酸α-脱羧酶为靶点设计的抗真菌、抗细菌药物和除草剂对动物或人类无害。 β-丙氨酸可用于合成肌肽、泛酸钙、巴柳氮及帕米磷酸钠等医药产品，用途非常广泛。目前国内β-丙氨酸主要采用化学合成法，存在成本高、生产条件对环境不友好等缺点，开发绿色安全的生物法生产工艺将具有十分明显的经济和社会效益。但目前筛选到的产酶菌株产酶量较低、酶活性低，难以规模化生产和广泛应用。 本研究通过传统纯培养技术，从亚热带海洋土壤沉积物样品中初步分离筛选到八十株具有L-天冬氨酸α-脱羧酶活性的菌株，经纸层析复筛后选择其中4株酶活力较高的菌株进行菌种鉴定。根据菌株的形态特征、生理生化特性、16S rRNA序列比对分析和系统发育分析，鉴定出这四株菌中有两株属于不动杆菌属（Acinetobacter spp.）、一株属于普罗维登斯菌属（Providencia spp.）、一株属于发光细菌属（Photobacterium spp.）。 以普罗维登斯菌株为研究对象，根据GenBank数据库中已有的普罗维登斯菌属天冬氨酸脱羧酶基因(panD)序列设计引物，PCR扩增获得L-天冬氨酸α-脱羧酶基因(panDP)。以pET-30a(+)为载体、Escherichia coli DH5α为宿主细胞，构建了重组菌。生物信息学分析结果表明panDP基因包含一个长为381bp的ORF，编码一个由126个氨基酸组成的多肽，分子量预测为13.92kDa。panDP基因在核苷酸水平上与Photorhabdus asymbiotica ATCC43949的aspartate1-decarboxylase precursor基因(GenBank登录号:FM162591.1)的一致性为81％;与Photorhabdus temperata subsp.thracensis strain DSM15199的aspartate decarboxylase基因(GenBank登录号:CP011104.1)的一致性为77％;在氨基酸水平上，PanDP与来自Providencia rettgeri的L-天冬氨酸α-脱羧酶（GenBank登录号:WP036958294.1）具有98％的一致性，但尚未发现其功能特征研究的相关报道。 将构建好的重组质粒pET-30a-panDP转入表达宿主E.coli(DE3)plysS中，构建重组表达菌株。诱导表达的最佳条件为:以终浓度10g/L的α-乳糖为诱导剂，30℃诱导10h。镍柱纯化蛋白进行酶学性质分析，结果表明:在以L-天冬氨酸为底物时，PanDP的最适反应温度为60℃，最适pH为8.0，在最适反应条件下，金属离子的终浓度为5mM时，Ca2+、Al3+、Fe3+对酶具有促进作用，其中Al3+的促进作用最高，可达到140％。而Na+、Ba2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+均有不同程度的抑制作用，Na+的抑制作用比较微弱，Mn2+、Mg2+、Cu2+的抑制作用比较明显。该酶在低温条件下，比较稳定，超过55℃后，随着时间的延长，稳定性变差，但该酶在80℃下，保存1h，仍具有40％的酶活。当pH值为8.0时，该酶稳定性最好，在pH值为5.0到9.5的范围内，仍保持40％以上的酶活力，在pH值为7.5到8.5的范围内，保持60％左右的酶活力;Km为0.01602mmol/L，Vmax为1.6861μmol/min，kcat值为0.28s-1。 对panDP基因进行定点突变，获得了四个突变体，分别为K9A，K9D，S25E，S25K;纯化这四个突变体蛋白，进行酶学性质研究，与野生重组酶PanDP相比，这四个突变体酶活性均丧失，由此可知氨基酸残基位点的第9位和第25位均与酶的活性相关。 本研究完成了Providencia sp.GZ1和Acinetobacter sp.GZ8野生型菌株的鉴定，panDP基因的高效表达和功能分析;PanDP酶的最适反应温度较高，达到60℃，在80℃下仍保留较高的酶活，较高的酶反应温度使其在工业生产中有一定的应用价值和参考价值。