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L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartateα-decarboxylase,PanD EC4.1.1.11)是微生物泛酸(由泛解酸和β-丙氨酸组成)生物合成途径中的关键酶,由panD基因编码,以丙酮酰基为催化活性中心,具有严格的底物特异性,可以催化L-天冬氨酸脱去α羧基生成β-丙氨酸。β-丙氨酸的合成途径只存在于微生物和植物细胞中,因此以L-天冬氨酸α-脱羧酶为靶点设计的抗真菌、抗细菌药物和除草剂对动物或人类无害。 β-丙氨酸可用于合成肌肽、泛酸钙、巴柳氮及帕米磷酸钠等医药产品,用途非常广泛。目前国内β-丙氨酸主要采用化学合成法,存在成本高、生产条件对环境不友好等缺点,开发绿色安全的生物法生产工艺将具有十分明显的经济和社会效益。但目前筛选到的产酶菌株产酶量较低、酶活性低,难以规模化生产和广泛应用。 本研究通过传统纯培养技术,从亚热带海洋土壤沉积物样品中初步分离筛选到八十株具有L-天冬氨酸α-脱羧酶活性的菌株,经纸层析复筛后选择其中4株酶活力较高的菌株进行菌种鉴定。根据菌株的形态特征、生理生化特性、16S rRNA序列比对分析和系统发育分析,鉴定出这四株菌中有两株属于不动杆菌属(Acinetobacter spp.)、一株属于普罗维登斯菌属(Providencia spp.)、一株属于发光细菌属(Photobacterium spp.)。 以普罗维登斯菌株为研究对象,根据GenBank数据库中已有的普罗维登斯菌属天冬氨酸脱羧酶基因(panD)序列设计引物,PCR扩增获得L-天冬氨酸α-脱羧酶基因(panDP)。以pET-30a(+)为载体、Escherichia coli DH5α为宿主细胞,构建了重组菌。生物信息学分析结果表明panDP基因包含一个长为381bp的ORF,编码一个由126个氨基酸组成的多肽,分子量预测为13.92kDa。panDP基因在核苷酸水平上与Photorhabdus asymbiotica ATCC43949的aspartate1-decarboxylase precursor基因(GenBank登录号:FM162591.1)的一致性为81%;与Photorhabdus temperata subsp.thracensis strain DSM15199的aspartate decarboxylase基因(GenBank登录号:CP011104.1)的一致性为77%;在氨基酸水平上,PanDP与来自Providencia rettgeri的L-天冬氨酸α-脱羧酶(GenBank登录号:WP036958294.1)具有98%的一致性,但尚未发现其功能特征研究的相关报道。 将构建好的重组质粒pET-30a-panDP转入表达宿主E.coli(DE3)plysS中,构建重组表达菌株。诱导表达的最佳条件为:以终浓度10g/L的α-乳糖为诱导剂,30℃诱导10h。镍柱纯化蛋白进行酶学性质分析,结果表明:在以L-天冬氨酸为底物时,PanDP的最适反应温度为60℃,最适pH为8.0,在最适反应条件下,金属离子的终浓度为5mM时,Ca2+、Al3+、Fe3+对酶具有促进作用,其中Al3+的促进作用最高,可达到140%。而Na+、Ba2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+均有不同程度的抑制作用,Na+的抑制作用比较微弱,Mn2+、Mg2+、Cu2+的抑制作用比较明显。该酶在低温条件下,比较稳定,超过55℃后,随着时间的延长,稳定性变差,但该酶在80℃下,保存1h,仍具有40%的酶活。当pH值为8.0时,该酶稳定性最好,在pH值为5.0到9.5的范围内,仍保持40%以上的酶活力,在pH值为7.5到8.5的范围内,保持60%左右的酶活力;Km为0.01602mmol/L,Vmax为1.6861μmol/min,kcat值为0.28s-1。 对panDP基因进行定点突变,获得了四个突变体,分别为K9A,K9D,S25E,S25K;纯化这四个突变体蛋白,进行酶学性质研究,与野生重组酶PanDP相比,这四个突变体酶活性均丧失,由此可知氨基酸残基位点的第9位和第25位均与酶的活性相关。 本研究完成了Providencia sp.GZ1和Acinetobacter sp.GZ8野生型菌株的鉴定,panDP基因的高效表达和功能分析;PanDP酶的最适反应温度较高,达到60℃,在80℃下仍保留较高的酶活,较高的酶反应温度使其在工业生产中有一定的应用价值和参考价值。