基于质谱的单细胞分析与酶反应监控方法研究

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细胞在生物体的生命活动中扮演着极其重要的角色,细胞中的代谢物与生物体的生长、分化、运动、凋亡、衰老等生物过程密切相关。因此,研究单细胞水平的代谢物不仅对于深入认识生命过程有非常重要意义,而且还能够对疾病的诊断和治疗提供指导。  本论文基于现代质谱技术建立了快速、简捷的探针取样的单细胞分析方法。通过对实心探针的多孔修饰和表面化学修饰,大大提高了探针的富集能力。同时还建立了基于电喷雾质谱的连续酶反应监控方法,并成功应用于乙酰胆碱酯酶及其抑制剂的动力学参数的快速测定。  首次建立了基于铜富集探针取样和MALDI-TOF-MS检测的单细胞分析平台,实现了单个洋葱表皮细胞的取样和分析,并观察到了洋葱内表皮和外表皮细胞间代谢物的差异。与传统的单细胞分析方法相比,本方法廉价易行,方便快速,适用于新鲜活体组织中单个细胞的原位取样和代谢物分析。  为了进一步提高探针的富集能力,采用脱合金化方法对实心黄铜探针进行了多孔化修饰,详细研究了酸种类、组成、浓度、腐蚀温度和时间等条件对富集效率的影响。研究结果表明,黄铜探针置于盐酸溶液中腐蚀,显著增加了探针的富集能力,大大提高了单细胞分析的灵敏度。  分别制备了八种表面修饰探针(氧化铜探针、氢氧化铜探针、草酸修饰铜探针、盐酸修饰铜探针、氯化钠修饰铜探针、氯化铵修饰铜探针、氨水修饰铜探针和硫酸铵修饰铜探针),系统研究了探针表面性质与富集能力的关系。实验结果表明,对铜探针进行氢氧化铜亲水修饰、草酸修饰和氯离子修饰均可以提高富集能力,而氧化铜疏水修饰和氨修饰则会降低富集能力。实心探针表面化学修饰是提高探针富集能力的又一有效方法。  建立了基于ESI-MS的乙酰胆碱酯酶酶促反应的连续监控方法。并成功应用于多个酶和抑制剂的动力学参数的准确测定,包括米氏常数(Km)、半数抑制浓度(IC50)、抑制常数(Ki)以及抑制类型。与常规终止法相比,实现了快速和自动化的实时酶反应监控和动力学参数测定,且可进一步应用于乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选研究。  本论文的研究扩展了现代质谱技术在生命科学领域中的应用,不仅为研究复杂体系中微量成分的快速灵敏的分析提供方法学参考,而且对于深入研究生命过程和疾病的诊疗有着重要的意义。
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