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人造血干细胞117蛋白(Hematopoietic stem/proenitor cells117,HSPC117)是最近新发现的一种与细胞粘附运动相关的蛋白,它存在于大多数的蛋白质复合物之中,在哺乳动物与啮齿动物体内广泛表达。HSPC117能够抑制细胞的粘附、铺展,参与调控某些组织器官的发育以及亲、子代间表型的差异变化,更与克隆胚胎的正常发生、发育密切相关,因此对HSPC117基因进行相关研究不仅为掌握该基因的更多功能提供必要信息,更为与其相关的科研领域奠定实验基础。
本实验以人HSPC117基因为研究对象,采用克隆测序、基因重组等方法构建了人pEGFP-C1-HSPC117真核表达载体,采用脂质体介导的转染方法将EGFP与HSPC117形成的融合蛋白瞬时转染入人绒毛膜癌细胞株JEG-3,通过对绿色荧光的观察对HSPC117基因进行亚细胞定位;采用Real-time PCR方法检测HSPC117基因过表达对细胞粘附相关基因MMP-2、MMP-14和TIMP-2基因表达的影响,利用细胞划痕方法构建培养细胞伤口模型,以细胞相对迁移速率评估HSPC117基因过表达对细胞迁移行为的影响。利用组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A(TSA)和DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-aza-CdR)以不同方式处理JEG-3细胞,检测细胞中HSPC117基因表达量变化情况。本实验研究结果如下:
(1)成功克隆了人HSPC117基因完整编码区序列,大小为1518bp,编码505个氨基酸。
(2)成功构建了pEGFP-C1-HSPC117真核表达载体,瞬时转染JEG-3细胞,荧光倒置显微镜观察到HSPC117蛋白主要表达于细胞质中,无明显的膜定位现象。
(3)瞬时转染pEGFP-C1-HSPC117重组质粒48h后,Real-time PCR检测JEG-3细胞中MMP-2基因、MMP-14基因和TIMP-2基因相对表达量变化情况。结果显示,伴随着HSPC117基因的过表达,MMP-2基因、MMP-14基因的相对表达量显著降低(P<0.05),TIMP-2基因相对表达量显著升高(P<0.05)。
(4)将瞬时转染pEGFP-C1-HSPC117质粒、pEGFP-C1质粒和未进行转染的JEG-3细胞同时进行细胞划痕试验,分别在划痕后0h、24h、48h和72h测量、计算各组细胞的相对迁移速率,实验结果显示,过表达HSPC117基因的JEG-3细胞细胞相对迁移速率与对照组相比受到抑制,且在划痕后24h抑制作用最明显(P<0.05)。
(5)利用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度TSA和5-aza-CdR对JEG-3细胞生长的影响,实验结果显示,两种药物均可对细胞生长起到抑制作用,且抑制作用具有浓度依赖性,75nmol/L的TSA和50nmol/L的5-aza-CdR分别是抑制JEG-3细胞生长的最强药物浓度。
(6)采用75nmol/L的TSA与50nmol/L的5-aza-CdR分别及联合处理JEG-3细胞,检测HSPC117基因mRNA的相对表达量变化。实验数据显示,除DMSO阴性对照组外,各处理组中HSPC117基因的相对表达量与空白对照组相比均有升高,其中50nmol/L的5-aza-CdR单独处理组与两种药物联合处理组HSPC117基因mRNA的相对表达量升高显著(P<0.05)。