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目的
研究和观察糙叶败酱大孔吸附树脂提取物 (Patrinia scabra Bunge extract,PsBe)的抗肿瘤作用,探讨其作用机制。
方法
1、利用正交试验法研究超声提取糙叶败酱总皂甙的最佳提取工艺。
2、利用D101型大孔吸附树脂分离糙叶败酱组份,进行多糖和皂甙含量的测定。
3、采用Sarcoma 180和Hepatoma 22腹水和实体移植肿瘤模型,观察PsBe的抗肿瘤作用,计算荷瘤小鼠生命延长率、抑瘤率,HE染色观察Hepatoma,22实体瘤肿瘤组织形态学变化,激光共聚焦显微镜检测Sarcoma 180腹水瘤细胞的DNA、RNA含量。
4、PsBe作用于Sarcoma 180腹水瘤荷瘤小鼠,计算荷瘤小鼠胸腺指数和脾脏指数,MTT 法等检测外周血淋巴细胞转化功能、NK细胞活性、LAK细胞活性和B细胞产生抗体能力,双抗体夹心ELISA法检测血清Th1型(IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α)和Th2型(IL-6、IL-10)细胞因子水平,细胞花环实验法检测红细胞C3b受体花环率、红细胞免疫复合物花环率和红细胞肿瘤细胞花环率,流式细胞仪检测红细胞膜CD35和CD44s数量。
5、PsBe作用于Sarcoma180腹水瘤荷瘤小鼠,透射电镜和荧光显微镜观察肿瘤细胞凋亡的形态学变化,Annexin V-FITC/PI双标记法检测肿瘤细胞早期凋亡率,琼脂糖凝胶电泳检测肿瘤细胞凋亡的DNA片段,RT-PCR法检测肿瘤细胞easpase-3的基因表达情况,免疫组织化学法检测肿瘤细胞Caspase-3的蛋白表达情况,流式细胞仪检测肿瘤细胞P53、Bcl-2、Bax蛋白表达情况,激光共聚焦显微镜检测肿瘤细胞线粒体膜电位(ΔΨm)、细胞间通讯(GJIC)、自由基含量和[Ca<2+>]的变化。
6、运用糙叶败酱复方扶正抑瘤颗粒(FYK)荷瘤小鼠含药血清作用于体外培养Hepatoma 22肿瘤细胞,激光共聚焦显微镜检测肿瘤细胞DNA、RNA含量、ΔΨm、GJIC、自由基含量和[Ca<2+>]的变化,Annexin V-FITC/PI双标记法检测肿瘤细胞早期凋亡率。
结果
1、糙叶败酱总皂甙超声提取的最佳工艺为:乙醇浓度65%,超声提取时间40min,超声提取温度55℃,超声功率210W。各种因素对总皂甙提取效果影响的权重依次为:超声功率、乙醇浓度、超声提取时间和超声提取温度。
2、糙叶败酱水提物大孔吸附树脂柱层析,20%乙醇洗脱液得2种组份,组份一中多糖含量54.4%,皂甙含量6.8%;50%7,醇洗脱液得 4 种组份,组份一中多糖含量34.8%,皂甙含量 34.4%,组份二中多糖含量 21.4%,皂甙含量 41.8%;80%乙醇洗脱液得1种组分。
3、PsBe作用于Sarcoma 180和Hepatoma 22腹水和实体移植肿瘤模型,均有一定的抗肿瘤作用,其中以Sarcoma 180腹水瘤模型作用最佳,同时,可造成Sarcoma 180细胞DNA、RNA含量下降。HE染色可见不同程度的肿瘤细胞减少,肿瘤间质内有以大量淋巴细胞为主的炎性细胞浸润,部分呈条带状。
4、PsBe作用于Sarcoma 180腹水瘤荷瘤小鼠,胸腺指数和脾脏指数增高;外周血淋巴细胞转化功能、NK细胞活性、LAK细胞活性和B细胞产生抗体能力增强;血清Th1型细胞因子水平升高,Th2型细胞因子水平降低;红细胞C3b受体花环率和红细胞肿瘤细胞花环率上升,红细胞免疫复合物花环率下降,红细胞膜CD35和CD44s数量增高。
5、PsBe作用于Sarcoma 180腹水瘤荷瘤小鼠,肿瘤细胞出现典型的凋亡形态学改变,琼脂糖凝胶电泳可见“DNA ladder”,细胞早期凋亡率升高;凋亡相关基因和蛋白caspase-3、P53、Bax表达增加,Bcl-2蛋白表达降低;肿瘤细胞ΔΨm下降,自由基含量和[Ca<2+>]增高,GJIC功能部分恢复。
6、FYK荷瘤小鼠含药血清作用于体外培养Hepatoma 22肿瘤细胞,细胞DNA、RNA含量和ΔΨm降低,细胞早期凋亡率、自由基含量和[Ca<2+>]升高,GJIC功能有所恢复。
结论
PsBe有一定的体内抗肿瘤作用,其作用机制与以下两个方面有关:
1 PsBe能够增强荷瘤机体的免疫功能。
2 PsBe可以诱导肿瘤细胞凋亡,其机理与PsBe改变肿瘤细胞caspase-3、P53、Bcl、Bax表达,调节肿瘤细胞Aym、自由基含量和[Ca<2+>],改善GJIC功能相关。