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细胞自噬是真核生物中一种十分保守的细胞内物质降解途径。在酵母细胞中,通过细胞自噬过程将细胞内错误折叠的蛋白和受损的细胞器等包裹形成自噬体送入液泡中降解,以实现物质的循环,从而帮助细胞渡过逆境。在高等真核生物中,细胞自噬还与多种生理和病理过程相关,如生长发育、免疫反应、程序性细胞死亡、肿瘤和神经退行性病变等。V-ATPase是一类大分子复合体,广泛分布在酵母及哺乳动物等真核生物的细胞膜及细胞器膜上。它以水解ATP产生的能量作为动力,将H+逆浓度梯度泵出细胞或泵入细胞器内,从而维持胞质和某些细胞器(如液泡(动物细胞中为溶酶体)、吞饮小泡、高尔基体等)的酸性,这有利于维持细胞内环境的稳定,是细胞进行各项生理活动的必要条件。在酵母细胞中V-ATPase复合体由14个不同的亚基组成,除a亚基外,其他亚基均只有一个基因编码。a亚基由VPH1和STV1编码,前者定位于液泡膜上,后者定位于高尔基和内体膜上。在酵母细胞中,自噬过程产生的自噬体融合入液泡后,在液泡水解酶类的作用下进行降解。而液泡水解酶类的活性依赖于V-ATPase所维持的酸性环境。近年来有研究表明细胞自噬与V-ATPase复合体或其亚基的表达水平相关,但V-ATPase复合体如何影响细胞自噬过程尚不清楚,因此本文重点探讨V-ATPase复合体亚基缺失后对细胞自噬的影响,得到如下两个方面的主要结果:1.V-ATPase复合体亚基单独或同时缺失影响细胞自噬GFP-Atg8的定位及降解和Ape1的运输和成熟可用于反映酵母细胞自噬的进行情况。在饥饿诱导的细胞自噬过程中,液泡膜上V-ATPase复合体亚基单独缺失后,部分GFP-Atg8堆积在液泡外的自噬体组装位点(PAS),另一部分GFP-Atg8能进入液泡内,但可能也只有部分被降解,因为液泡内存在野生型液泡内不存在的荧光亮点堆积情况,这些表型在vph2△和vma6△突变体中尤为明显。此外,V-ATPase复合体亚基单独缺失后Ape1的成熟也受到了抑制。对V-ATPase单突变体进行基因回补后,这些突变体的细胞自噬情况恢复正常。V-ATPase复合体的两个亚基同时缺失后,细胞自噬缺陷变得更严重,表现为GFP-Atg8的降解和Ape1的成熟程度比单独缺失一个亚基时更低。另外,部分V-ATPase复合体亚基单独缺失可能影响Atg9的运输及定位。例如,vma6△、vma3△、vph2△以及vma10A突变体细胞中的Atg9-3GFP堆积于液泡边缘,不同于野生型细胞中Atg9-3GFP分布于细胞质中液泡外周的细胞器膜上,说明了 V-ATPase复合体亚基的缺失可能影响了 Atg9的逆向运输。在敲除ATG1的背景下检测Atg9-3GFP的定位,发现不同于野生型细胞中Atg9有且只有一个定位于PAS的点,大部分V-ATPase突变体菌株中Atg9-3GFP出现了多点的情况,尤其是在vma7△、vma5△、vma10△、vma16△、vph2△、vma21△ 突变体。并且除 vph1△外的 V-ATPase突变体细胞中Atg9-3GFP不能很好地定位于PAS上,尤其是在vph2△、vma6△突变体中。对碱性环境敏感是V-ATPase突变体的一种表型,但不同的突变体对碱性的敏感程度不一样。我们发现突变体对碱性越敏感,其GFP-Atg8的降解量越少。据此我们推测,V-ATPase亚基对细胞自噬的影响可能是通过其对液泡酸性的调节来作用的。2.V-ATPase复合体a亚基的两个亚型Vph1和Stv1同时缺失影响细胞自噬VPH1是编码液泡膜V-ATPase上a亚基的基因,STV1是编码高尔基体/内体膜V-ATPase上a亚基的基因,它们单独缺失对细胞自噬没有影响。但在VPH1和STV1同时缺失的vph1△stv1△突变体中自噬小体堆积于液泡内不能降解,导致GFP-Atg8的降解和Ape1的成熟出现阻碍。当回补VPH1和/或STV1时,双突变体中Atg8的降解和Ape1的成熟均能恢复到正常的水平。另外,vph1△stv1△双突变体中的Atg9-3GFP会在液泡边缘形成较亮的点,可能影响了 Atg9从PAS位点向外周的细胞器膜的运输。在ATG1敲除的背景下,vph1△stv1△双突变体中的Atg9-3GFP出现在多个位置,且大部分不能正确定位到PAS位点上。进一步探讨vph1△stv1△中细胞自噬严重缺陷的可能原因,发现单独缺失VPH1或STV1时细胞对碱性环境不敏感,同时失去这两个基因时细胞对碱性环境敏感。我们推测vph1△stv1△双突变体的细胞自噬缺陷可能是因为细胞中完全无法编码V-ATPase复合体的a亚基,导致液泡内环境发生改变,致使液泡内水解酶类不能很好地降解自噬小体造成自噬缺陷。以上结果表明酿酒酵母中大部分V-ATPase复合体亚基缺失影响细胞自噬。尽管Vph1和Stv1单独缺失对细胞自噬没有明显影响,但同时缺失时,会导致自噬体堆积于液泡中不能降解,从而严重阻碍了细胞自噬的正常进行。这些结果为阐释V-ATPase复合体在细胞自噬中的作用和调控机制提供了重要的理论与实验依据。