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研究背景:趋化因子是由小分子蛋白构成的细胞因子,能吸引白细胞迁移到感染部位,发生免疫学效应,它在机体炎症反应中具有关键作用。CXC趋化因子是趋化因子超家族的重要成员,与机体的炎症反应、损伤修复、血管形成和肿瘤的发生发展、转移侵袭等过程密切相关。其中,趋化因子CXCL8由上皮细胞和巨噬细胞等分泌,有CXCR1和CXCR2两个受体,它通过与两个受体的结合发挥对T细胞、中性粒细胞等机体内多种炎症细胞的趋化作用,它还在肿瘤细胞内表达,并参与肿瘤的血管生成和转移侵袭的过程。G31P是CXCR1/2受体拮抗剂,可与CXCR1/CXCR2受体高亲和力结合,但没趋化活性的CXCL8衍生物,它是通过基因定点突变方法构建所得到的,可与IL-8竞争性结合CXCR1/CXCR2受体,从而阻断IL-8与CXCR1/CXCR2的结合,发挥抗炎抗肿瘤的作用。吉非替尼是非小细胞肺癌的靶向治疗药物,常用于治疗转移性非小细胞肺癌(NSCLC)患者和接受过化疗的局部晚期肺癌患者,它是一种选择性表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂,通过选择性抑制表皮生长因子受体酪氨酸激酶(EGFR-TK)而发挥作用。高剂量的吉非替尼可接受和转化表皮生长因子,从而刺激成纤维细胞增殖,这是造成肺损伤的重要发病机制。但研究发现,低剂量的吉非替尼能抑制表皮生长因子的增殖,从而抑制肺损伤的形成。博来霉素属碱性糖肽类广谱抗肿瘤药,它能抑制胸腺嘧啶核苷参入DNA并与之结合,使得DNA链断裂,常作用于增殖细胞周期的S期。博来霉素应用广泛,可治疗多种肿瘤,如鳞癌,包括皮肤、头颈部、阴道、宫颈、肺、食道等癌肿以及脑瘤、恶性淋巴瘤、恶性黑色素瘤等。博来霉素常见的不良反应有恶心、呕吐等,但最严重的是引起肺部的间质性肺炎,即纤维性肺泡炎(也称为肺纤维化、肺损伤),其致病性可高达10%。研究目的:本实验通过cxcr1/2的拮抗剂g31p与低剂量吉非替尼的联合用药,观察联合用药对小鼠肺癌a549细胞的抑制作用,并研究联合用药对博来霉素导致小鼠肺损伤的影响,为减轻化疗药物的毒副作用提供新的帮助。研究方法:(1)体内实验:建立博来霉素诱导的肺损伤动物模型:取c57bl/6j雌性小鼠60只,随机分为5组,分别为正常对照组(control组)、博来霉素组(blm组)、吉非替尼组(gef组)、吉非替尼+g31p组(gef+g31p组)、g31p组,每组12只。博来霉素组(blm组)、吉非替尼组(gef组)、吉非替尼+g31p组(gef+g31p组)、g31p组经气管注射博来霉素0.5mg/kg,control组经气管给予同等剂量生理盐水注射,缝合气管,密切观察老鼠活动状态和体重变化。gef+g31p组和g31p组小鼠隔天经背部皮下注射g31p500μg/kg,其它各组同部位同等剂量注射生理盐水,gef组和gef+g31p组每周5天经胃给予吉非替尼(100mg/kg)。21天后,处死全部老鼠,进行标本采集和处理。取小鼠眼球血于ep管中,把小鼠双侧肺组织从体内剥离,观察各组小鼠肺组织的炎症反应状态,1/4肺组织固定于4%福尔马林溶液中,日后进行病理学检测,其余放于空白ep管中,用于检测mpo活力、提取蛋白进行western检测、提取rna进行pcr检测炎症细胞因子的表达、inos含量的测定等。(2)体外实验:体外培养肺癌a549细胞,分别用细胞增殖实验、细胞迁移实验等来检测低剂量的吉非替尼联合g31p对a549细胞体外增殖的影响。研究结果:(1)体内实验:对老鼠肺组织大体观察,control组肺部正常,无炎症反应发现;blm组老鼠炎症反应最明显,肺部组织淤红;相比blm组,其它各组炎症反应都有一定程度的缓解,其中gef+g31p组炎症最轻。组织病理学结果表明,control组正常,blm组老鼠的肺泡内全部充满红细胞,无明显肺泡组织;与其它组相比,g31p组和gef组肺泡内红细胞明显减小且存在肺泡组织,g31p+gef组肺泡内基本无红细胞,肺泡组织学形态正常。从老鼠的体重趋势和死亡率来看,g31p+gef组体重基本与control组相当,其它三组体重明显下降,以BLM组下降最为明显。G31P+Gef组死亡率明显低于BLM组、G31P组和Gef组,BLM组老鼠死亡率高达50%,G31P组和Gef组死亡率分别为30%和40%。通过qRT-PCR结果显示,BLM组老鼠炎症标记物TNF-α(p<0.05),IL-1β(p<0.05)、IL-1(p<0.05)IL-5(p<0.05)和IL-6(p<0.05)明显高于其它四组。相比之下,Control组的TNF-α(p<0.05)、IL-1(p<0.05)、IL-5(p<0.05)和IL-6(p<0.05)的mRNA的表达水平最低,其它依次为G31P+Gef组、G31P组、Gef组。通过Western-blot结果显示,相对于Control组,G31P联合吉非替尼更能明显抑制肺损伤组织的NF-кB(p<0.05)的表达。相比,BLM组蛋白标记物的表达最低,其次分别为Gef组、G31P组。对小鼠体内髓过氧化物酶(MPO)和一氧化氮合酶(iNOS)测定,结果表明G31P联合吉非替尼可以明显降低小鼠肺组织中MPO和iNOS的含量。(2)体外实验:用细胞抑制、细胞迁移等实验来检测G31P和吉非替尼对A549细胞的增殖和毒性作用,单独使用G31P组的结果显示对A549细胞没有明显抑制作用;G31P与低浓度吉非替尼联合应用,对A549细胞有明显的细胞抑制作用;G31P与高浓度的吉非替尼联合应用,对A549细胞的抑制作用结果也不太明显。结论:(1)G31P与低剂量的吉非替尼联合用药方案可以明显抑制肺癌A549细胞的生长,迁移。联合用药对肺癌A549细胞的抑制作用明显强于单独用吉非替尼组和单独用G31P组。(2)G31P联合低剂量的吉非替尼可以减轻博来霉素导致的肺损伤。相比单独用吉非替尼和G31P,G31P联合吉非替尼减轻了老鼠肺病理损伤,减少了TNF-α、IL-1、IL-5、IL-6等炎性细胞因子的表达,减少肺组织中性粒细胞浸润,更好地提高了老鼠的生命质量和小鼠生存率。