拟南芥AZI1(At4g12470)基因编码的蛋白质属于HyPRP家族EARLI1亚家族,由N端的信号肽、中间的富含脯氨酸结构域(PRD)以及C端的8半胱氨酸结构域(8CM)构成。由于包含8CM结构域,AZI1也被认为是脂转移蛋白(LTP)家族的一个成员。已有的研究结果表明,与许多LTP蛋白一样,AZI1在拟南芥应答病原体侵染过程中具有重要作用。本工作通过农杆菌遗传转化技术将AZI1基因导入烟草基因组,利用转基因烟草植株研究了它的亚细胞定位特征以及它对灰霉菌等植物病原体的抗性功能。本工作在利用PCR技术克隆AZI1基因时,首先通过DNAStar软件中的MapDraw程序对编码序列进行了限制性作图分析,在设计的上下游引物5’-端分别引入了编码序列内部不存在的Nco Ⅰ和Spe Ⅰ酶切位点,然后以Col-0基因组DNA为模板、采用高保真耐热DNA聚合酶Pfu扩增得到AZI1基因的开放阅读框序列。进一步采用Nco Ⅰ和Spe Ⅰ对扩增产物和pCAMBIA1302载体进行双酶切,通过T4DNA连接酶构建产生AZI1-GFP融合表达载体。经过测序验证后,将重组质粒导入农杆菌LBA4404受体细胞,接着用菌落PCR鉴定后的农杆菌细胞转化烟草的叶片外植体,在潮霉素抗性培养基上再生得到转基因烟草植株。PCR、RT-PCR以及Southern印迹实验结果显示,AZI1基因已经整合到烟草基因组DNA中,而且能够有效表达。激光共聚焦显微观察发现,AZI1蛋白定位在细胞表面,这与其具有信号肽的结构特征一致。用灰霉菌孢子在离体条件下侵染转基因烟草和野生型烟草叶片,结果证明AZl1转基因烟草对真菌病原体具有一定的抗性。DAB和台盼蓝染色结果也说明AZI1基因具有抵抗生物胁迫的功能。为了证实AZI1蛋白的抗真菌活性,本工作同时构建了原核表达载体,利用大肠杆菌细胞制备了不具有信号肽的AZI1重组蛋白。首先以拟南芥Col-0生态型基因组DNA为模板扩增得到AZI1基因的PRD-8CM编码序列,经Xho I和EcoR I酶切后用T4DNA连接酶构建产生pET28a-AZI1原核表达载体；进一步将测序正确的重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)受体细胞,用IPTG对AZI1重组蛋白进行了诱导表达。Western免疫印迹实验结果显示,AZI1重组蛋白主要以包涵体的形式存在。体外抑菌实验以及激光共聚焦显微观察结果表明,采用镍离子亲和层析柱纯化的AZI1重组蛋白对灰霉菌和酿酒酵母细胞均具有抑制作用。