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醛糖还原酶相似蛋白(aldo-keto reductase family1 member B10,ARL-1,AKR1B10)是醛酮还原酶超家族(aldo-keto reductases,AKRs)成员分子。它以NADPH作为辅酶还原各种醛酮化合物为醇,发挥代谢作用,其作用底物广泛,参与细胞多项生理代谢活动,包括代谢有害羰基化合物,清除体内活性氧自由基,调节脂肪酸合成等。但是正常情况下其表达谱较窄,主要表达在人小肠、结肠、肾上腺等组织,最近研究显示其在正常肝脏组织中亦有较弱表达,与之形成对比的是AKR1B10在多种肿瘤组织中表达上调,包括肺癌、肝癌、直肠结肠癌、乳腺癌、口腔癌和宫颈癌等,现己将其作为肿瘤标志物进行研究。Heringlake最新研究显示,AKR1B10的表达与原发性肝癌的分化程度具有相关性,在高、中分化肝癌中.AKR1B10表达上调,但在低分化肝癌中AKR1B10表达下调。还有研究显示暴露于香烟冷凝液等有害环境因素下的人正常肺上皮细胞和肺鳞状肿瘤细胞均表现出AKR1B10基因活化并表达上调。
本研究前期克隆并表达了AKR1B10全长融合蛋白并用它作为抗原免疫小鼠,获得了15株单克隆抗体。由于是使用全长蛋白作为抗原,所得抗体针对的抗原表位并不明确,本研究克隆表达截短AKR1B10蛋白,分析抗体所针对优势抗原表位区段；另外AKR1B10在胃癌、食管癌中的表达未见报道,本实验选用AKR1B10单克隆抗体1D6,利用免疫组织化学法(ABC法)对26例食管癌以及22例胃癌组织石蜡切片标本进行检测并结合肿瘤的临床病理资料进行统计分析；本文还利用蛋白免疫印迹实验(Western Blot,WB)检测了MHCC-97H、MHCC-97L两株肝癌细胞系培养上清中.AKR1B10的表达。结果如下：
⑴两次克隆表达截短AKR1B10融合蛋白,第一次将全长蛋白截为三段,得到GST-AKR1B10-1、GST-AKR1B10-2、GST-AKR1B10-3三个融合表达蛋白,间接酶联免疫吸附实验(ELISA)分析发现15株单抗均识别GST-AKR1B10-2,在此实验基础上将第二段进一步截短表达,得到GST-AKR1B10-2-1、GST-AKR1B10-2-2两个融合表达蛋白,ELISA分析发现14株单抗能同时识别两段截短蛋白,1株单抗1287仅识别GST-AKR1B10-2-1,以上结果显示AKR1B10优势抗原表位可能分布在GST-AKR1B10-2内,也就是全长蛋白的105-205位氨基酸之间。
⑵用自制单克隆抗体1D6,通过免疫组化方法检测了22对胃癌和相应癌旁组织AKR1B10表达情况,在31.8％(7／22)的胃癌组织标本中AKR1B10的表达呈阳性,在100％的癌旁正常组织中高表达,且集中表达于胃黏膜上皮细胞。WB检测胃永生化细胞系GES-1和胃癌细胞系BGC823、MKN45、SGC7901、MCG803,没有检测到AKR1B10的表达。
⑶用1D6抗体,通过免疫组化方法检测了26对食管癌和相应癌旁组织AKR1B10表达情况,结果显示,AKR1B10在88.5％(23／26)的食管癌组织中呈阳性表达,在61.5％(16／26)癌旁组织中AKR1B10表达呈阳性,且集中表达于食道黏膜上皮细胞；有65.4％(17／26)的食管癌组织标本表达强于癌旁,统计分析发现AKR1B10表达与食管癌病理分型和肿瘤转移相关性没有统计学意义。WB检测胚胎食管永生化细胞系H5E46和食管癌细胞系Eca9706、CaEs17、SHEEC、KYSE-150中AKR1B10的表达,结果显示胚胎食管黏膜永生化细胞H5E46以及食管癌细胞CaEs17、SHEEC、KYSE-150中有.AKR1B10的表达。
⑷用1D6抗体,通过WB方法检测了肝癌细胞系MHCC-97L、MHCC-97H,结果显示在细胞总蛋白和细胞培养上清中均检测到AKR1B10。以上结果为进一步深入研究AKR1B10分子与肿瘤发生发展的相关性及意义提供了有效的研究工具及实验基础。