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目的:骨折疼痛是创伤患者最主要的临床症状之一,也是患者寻求医疗帮助时的第一主诉。尤其对于四肢骨折的患者,创伤后组织损伤引起的局部炎症反应是机体进行坏死组织清理和骨愈合过程中的重要环节,也是疼痛产生的主要原因。早期制动和复位有助于加速骨愈合,却无法有效制止疼痛的形成,很多患者甚至在骨折愈合后仍然饱受慢性疼痛的困扰。目前除了给予非甾体类抗炎药和阿片类药物对症治疗外,并无有效的靶向药物。而充分控制疼痛,不仅可以减轻痛苦,更有利于患者恢复功能锻炼促进损伤愈合,因此骨折后病人的疼痛管理尤为重要。本课题采用小鼠骨折创伤模型模拟构建复杂性区域疼痛综合征(Complex regional pain syndrome,CRPS)模型,利用新型小胶质细胞标记物跨膜蛋白119(Transmembrane protein 119,Tmem119)评估慢性疼痛病程中小胶质细胞的活化特性,同时也对不同性别小鼠的中枢变化和治疗前后的疼痛表现进行分析比较。方法:通过胫骨远端闭合性骨折合并石膏固定建立CRPS小鼠模型,并在术后进行后足背部皮温、脚爪厚度、后肢承重分布及机械痛缩爪阈值(Mechanicalwithdraw threshold,MWT)的测量,验证造模后的疾病临床表现。并采用机械刺激逃避测试(Mechanical conflict avoidance,MCA),通过测试动物的自主性行为,评价小鼠自发性疼痛状态。在造模后的第1天、第1周、第3周和第7周多个时间点取材,使用免疫组织荧光染色和流式细胞术,定性和定量分析腰椎脊髓背角中小胶质细胞的活化状态及CD11b和Tmem119的表达变化。此外,在第3周石膏拆除后行鞘内注射脂多糖球形红细菌(Lipopolysacchariderhodobactersphaeroides,LPS-RS),作用于小胶质细胞表面的Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)并抑制其活化,观察雌雄小鼠在治疗后的机械痛阈值变化。结果:小鼠模型在石膏拆除后均表现出典型的CRPS体征,如皮温升高,远端肢体水肿,患侧承重能力下降及持续性疼痛。术前小鼠的后爪温度均值在23.4±0.6℃,术后对侧皮温无显著改变,雌雄小鼠患侧后爪温度均比对侧正常温度高约1.5℃。术前的后足脚爪厚度均值为1.4±0.8 mm,而术后雄性和雌性小鼠的患侧平均脚爪厚度相比对侧分别增加了 0.36±0.08 mm和0.45±0.02 mm。在后肢负重表现方面,雌雄小鼠术后的患肢承重数值均下降至术前标准的56±4.3%。患侧后爪均明显表现出持续性的痛觉过敏,3-9周时MWT均显著下降(P<0.001),9周后逐步改善,至第20周时恢复至术前水平。以上体征在不同性别之间均无统计学差异(P>0.05)。在MCA测试中,CRPS小鼠3周后逃逸潜伏期显著升高。在探针高度为5 mm时,术前正常的雄性和雌性小鼠的逃逸潜伏期分别为15.8±1.7秒和24.8±6.7秒,造模3周后,雌雄小鼠的测试结果均为1分钟以上,升高至3倍左右(P<0.01)。在探针高度为2 mm时,雄鼠的逃逸潜伏期已经有显著升高(P<0.01),而雌鼠则没有(P>0.05)。提示雄性小鼠对低程度刺激更为敏感。免疫荧光染色结果表明,术后小鼠的腰椎脊髓背角区域内小胶质细胞发生活化并反应性增生。细胞表现出阿米巴样改变,表面标记物CD11b及Tmem119的表达量显著升高。统计阳性细胞所占背角区域面积的百分比发现,雄性小鼠的CD11b+细胞反应性增生在术后3周达到峰值(P<0.001),约为对照组的5倍,并持续至第7周。Tmem119的表达量则在术后1天升高至1.5倍(P<0.05),术后一周时下降至正常水平(P>0.05)。相比而言,雌性小鼠的激活时段则较为延迟,3周后CD11b+细胞才开始逐渐增加,第7周升至2倍到达峰值(P<0.01),而Tmem119则无明显变化。在高表达CD11b的细胞中,观察到三种不同Tmem119表达量的亚群,并且分布比例具有时间和性别异质性。运用流式细胞术筛选活化的小胶质细胞,观察到相同特点的细胞亚群。雄性小鼠在术后1天时,Tmem119hi+细胞比例显著增加(P<0.001),Tmem119mid+细胞则明显减少(P<0.001),术后1周时细胞比例趋近于术前水平。而雌性小鼠无显著变化(P>0.05)。雄性术后以Tmemhi+细胞比例最高,雌性则以Tmemmid+细胞为主,同时Tmemlo细胞在雌性体内占比相对较高。在分组治疗后,生理盐水组雌雄小鼠MWT均无明显变化。LPS-RS组中,雄性小鼠在给药1小时后MWT显著升高(P<0.05),疼痛缓解持续4个小时(P<0.001),6小时后下降至给药前水平(P>0.05),而雌性小鼠在给药前后均无明显变化(P>0.05)。另外,鞘内注射后4小时内,相同时间点的雌雄小鼠之间MWT有显著差异(P<0.001)。结论:成功构建了胫骨远端闭合性骨折合并石膏固定的小鼠动物模型,较好模拟了 CRPS疾病的多个典型体征。小鼠出现患肢痛觉过敏和一系列外周炎症反应。在慢性期小鼠表现出持续性疼痛,且雄性小鼠对低程度刺激更为敏感。伴随着中枢神经系统小胶质细胞的活化增殖,出现了 Tmem119表达量不同的3种亚群,并且亚群细胞的相对比例随着时间和性别的变化而不同。通过TLR4竞争性抑制剂只能有效缓解雄性小鼠的疼痛,但对雌性没有明显效果。在今后小胶质细胞调节药物的研究中,需要对不同分化的亚群进行分类讨论,同时应考虑性别因素和疼痛病程的长短,从而找到特异性和敏感性更高的治疗手段,大大提高临床转化效率。