研究背景:食管鳞癌作为消化系统常见恶性肿瘤,其发病率和死亡率均占据前列。可变剪接是RNA前体剪接过程中以多种剪接方式连接外显子,从而形成多种剪接异构体的过程。机体可变剪接受到顺式作用元件以及剪接因子等反式作用因子调控。可变剪接调控失常是肿瘤发生发展的重要机制之一,致癌的可变剪接会致使肿瘤增殖、侵袭、免疫逃避、耐药等恶性表型。针对肿瘤特异性可变剪接,可以研发m RNA疫苗、剪接转换寡核苷酸（Splice-Switching Oligonucleotide,SSO）等肿瘤防治药物。目前食管鳞癌中可变剪接表达特征,以及剪接因子对可变剪接调控研究较少、机制尚未明确。我们对食管鳞癌可变剪接进行生物信息学分析并探讨相关剪接因子在食管鳞癌中作用与机制,对发现食管鳞癌诊治新靶点具有重要意义。第一部分食管鳞癌可变剪接生物信息学分析目的:探讨食管鳞癌中可变剪接事件的表达特征及对生物学功能的影响,分析剪接因子与可变剪接的关联,并筛选出食管鳞癌中发挥重要作用的剪接因子。方法:对癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）队列中的81例食管鳞癌组织和11例癌旁组织进行研究。使用R软件中psichomics包对TCGA食管鳞癌队列中可变剪接事件进行注释与定量。用Wilcoxon秩和检验比较食管鳞癌组织和癌旁组织可变剪接事件的差异,筛选差异可变剪接事件。对食管鳞癌中差异可变剪接对应的基因进行生物功能富集分析。然后使用单因素Cox回归分析,筛选影响食管鳞癌患者预后（包括总生存期和无进展间期）的差异可变剪接事件。对剪接因子表达水平和可变剪接事件进行Pearson相关性分析。随后,在差异表达的剪接因子中使用单因素Cox回归分析和随机森林方法筛选影响食管鳞癌预后的剪接因子。最后对剪接因子进行泛癌表达分析。结果:1.在食管鳞癌样本的11363个基因中初步检测到35144例可变剪接事件。其中外显子跳跃（Skipped Exon,SE）15813例,占总可变剪接事件的44.9%。使用过滤条件（0.05＜拼接百分比（Percent-spliced-in,PSI）＜0.95且在75%以上样本中表达）进行筛选后得到6918个基因中的16856例可变剪接事件,筛选后SE仍为最为常见的可变剪接类型。2.使用Wilcoxon秩和检验比较食管鳞癌组织和癌旁组织可变剪接事件PSI的差异,筛选出来自584个基因的799个差异可变剪接事件。剔除了相应基因具有表达差异的可变剪接事件,最终得到来自498个基因的676个差异可变剪接事件。其中在食管鳞癌中有291个可变剪接事件的PSI值上调,385个可变剪接事件的PSI值下调。对食管鳞癌中差异可变剪接事件对应的基因进行基因本体（Gene ontology,GO）富集分析显示,相应基因在细胞连接组装、细胞-基质粘附调节、粘着斑和钙粘蛋白结合等中显著富集;京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析显示,相应基因在粘着斑、蛋白多糖与肿瘤、肌动蛋白细胞骨架调节等中显著富集。3.单因素Cox回归分析结果显示,有27例可变剪接事件是食管鳞癌患者总生存期的影响因素,31例可变剪接事件是食管鳞癌患者无进展间期的影响因素。REPS1和NIPAL3的可变剪接与食管鳞癌患者总生存期和无进展间期均密切相关。4.使用Pearson相关系数分析表明,食管鳞癌中653个差异可变剪接事件受到58个剪接因子调控。此外,一个可变剪接事件最多由9个剪接因子调控,一个剪接因子最多调控36个可变剪接事件。5.使用随机森林方法筛选出17个和16个剪接因子,分别与食管鳞癌患者总生存期和无进展间期密切相关。按相对重要性排名,RBM17和ZC3H14在食管鳞癌患者总生存期预后中起到重要作用,HNRNPH3、PRRC1和SRSF2在食管鳞癌患者无进展间期预后中起到重要作用。HNRNPA1是食管鳞癌患者总生存期和无进展间期预后重要因素。6.HNRNPA1在泛癌中表达分析表明,其在大多数肿瘤中表达水平均显著高于相应正常组织或者癌旁组织。结论:可变剪接在食管鳞癌中有着复杂的表达和调控模式,可变剪接事件相应基因与食管鳞癌细胞-基质粘附调节、粘着斑和钙粘蛋白结合等恶性生物学特征相关,并且可变剪接事件影响食管鳞癌患者预后。HNRNPA1等剪接因子在食管鳞癌患者预后中发挥重要作用。第二部分剪接因子HNRNPA1对食管鳞癌细胞恶性表型影响探讨目的:探讨剪接因子HNRNPA1在食管鳞癌中表达情况及对食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭等恶性表型的影响。方法:收集食管鳞癌临床标本,通过RT-q PCR分析HNRNPA1在食管鳞癌组织中表达情况。使用sh RNA慢病毒载体构建稳定敲低HNRNPA1的食管鳞癌细胞。通过CCK8细胞增殖实验和克隆形成实验,检测稳定敲低HNRNPA1对食管鳞癌细胞增殖的影响。使用Transwell实验检测稳定敲低HNRNPA1对食管鳞癌细胞迁移和侵袭能力的影响。使用裸鼠成瘤实验检测稳定敲低HNRNPA1在体内对食管鳞癌细胞增殖的影响。结果:1.在35例食管鳞癌样本和对应的癌旁组织中,RT-qPCR实验结果显示食管鳞癌组织中HNRNPA1表达水平显著高于癌旁组织。2.应用慢病毒sh RNA成功构建了稳定敲低HNRNPA1的食管鳞癌细胞株KYSE-410和KYSE-30。3.CCK8细胞增殖实验和克隆形成实验显示,稳定敲低HNRNPA1后食管鳞癌细胞KYSE-410和KYSE-30的增殖能力显著降低。4.Transwell实验结果显示敲低HNRNPA1可以抑制食管鳞癌细胞KYSE-410和KYSE-30的迁移和侵袭能力。5.裸鼠皮下成瘤实验显示敲低HNRNPA1可以抑制食管鳞癌细胞KYSE-30在体内的增殖能力。结论:剪接因子HNRNPA1在食管鳞癌组织中表达水平显著高于癌旁组织。敲低HNRNPA1可以抑制食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭等恶性表型。第三部分剪接因子HNRNPA1调控KIF23可变剪接在食管鳞癌细胞恶性表型中作用研究目的:探讨剪接因子HNRNPA1通过调控可变剪接促进食管鳞癌细胞恶性表型的分子机制。方法:通过对HNRNPA1敲低的食管鳞癌细胞进行RNA测序,筛选出与HNRNPA1相关的可变剪接事件。使用GSVA富集分析研究HNRNPA1敲低后显著变化的信号通路。使用RT-PCR实验检测HNRNPA1敲低后食管鳞癌细胞中可变剪接的变化趋势,同时在食管鳞癌临床样本中使用RT-PCR实验验证可变剪接的表达情况。在TCGA食管鳞癌队列中分析HNRNPA1基因表达与可变剪接事件的关联。使用核糖核酸免疫沉淀（RNA Immunoprecipitation,RIP）实验验证HNRNPA1与可变剪接相应基因的结合。使用剪接转换寡核苷酸（Splice-Switching Oligonucleotide,SSO）转染食管鳞癌细胞,调控可变剪接。使用RT-PCR实验检测SSO干扰可变剪接效率。使用CCK8细胞增殖实验、克隆形成实验、Transwell迁移和侵袭实验和裸鼠成瘤实验检测SSO干扰可变剪接对食管鳞癌细胞恶性表型影响。在稳定敲低HNRNPA1食管鳞癌细胞中进行SSO转染,并使用CCK8细胞增殖实验、克隆形成实验、Transwell迁移和侵袭实验检测对食管鳞癌细胞恶性表型的影响。结果:1.RNA测序结果显示在食管鳞癌细胞KYSE-30中敲低HNRNPA1后,1206例可变剪接事件的PSI值上调、1076例可变剪接事件的PSI值下调。GSVA通路富集分析显示,在食管鳞癌细胞KYSE-30中敲低HNRNPA1后,肿瘤相关的MYC信号通路受到显著抑制。2.RNA测序结果与TCGA食管鳞癌中差异的可变剪接事件取交集,筛选出KIF23外显子19可变剪接。3.RT-PCR实验显示在KYSE-410和KYSE-30中稳定敲低HNRNPA1后,KIF23长异构体表达增多并且PSI值显著增加,验证了HNRNPA1调控KIF23可变剪接。4.TCGA食管鳞癌样本中KIF23可变剪接PSI值与HNRNPA1表达水平负相关。5.RT-PCR显示食管鳞癌组织中KIF23可变剪接的PSI值显著低于癌旁正常组织。6.RIP实验显示HNRNPA1可与KIF23结合。7.使用SSO-KIF23转染促进食管鳞癌细胞KIF23外显子19跳跃,KIF23短异构体表达相对增多。转染SSO-KIF23后食管鳞癌细胞株KYSE-410和KYSE-30细胞增殖、迁移和侵袭能力增强。在裸鼠瘤内注射SSO-KIF23可以促进食管鳞癌增殖。8.在敲低HNRNPA1的食管鳞癌细胞中转染SSO-KIF23后,细胞增殖、迁移和侵袭等恶性表型能够恢复。结论:HNRNPA1通过调控KIF23可变剪接,促进KIF23短异构体表达增多,而促进食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭等恶性表型。第四部分剪接因子HNRNPA1调控KIF23可变剪接通过介导MYC激活在食管鳞癌细胞中发挥促癌作用研究目的:探讨食管鳞癌细胞中HNRNPA1调控KIF23可变剪接,发挥促癌作用的分子机制。方法:使用RT-qPCR实验检测在食管鳞癌细胞中敲低HNRNPA1或干扰KIF23可变剪接后,MYC及其下游基因转录水平的表达变化。使用Western Blot验证在食管鳞癌细胞中敲低HNRNPA1或干扰KIF23可变剪接后,蛋白水平上KIF23、MYC及其下游靶基因的表达趋势。在干扰KIF23可变剪接的食管鳞癌细胞中敲低MYC。使用CCK8细胞增殖实验、克隆形成实验、Transwell迁移和侵袭实验等,检测MYC在HNRNPA1调控KIF23可变剪接介导的食管鳞癌细胞增殖等恶性表型中作用。结果:1.RT-q PCR实验提示食管鳞癌细胞KYSE-410和KYSE-30中敲低HNRNPA1后MYC及其下游基因AIMP2、CDC25A、EIF4E和SRM等表达水平降低;干扰KIF23可变剪接可以恢复MYC及其下游基因的表达。2.Western Blot实验显示KYSE-410和KYSE-30细胞中敲低HNRNPA1后,KIF23、MYC和下游调控基因CDC25A及SRM在蛋白水平上表达下调;干扰KIF23可变剪接可以恢复KIF23、MYC及下游基因蛋白的表达。3.食管鳞癌细胞中敲低MYC可以恢复干扰KIF23引起的细胞增殖、迁移和侵袭等恶性表型增强。结论:在食管鳞癌细胞中敲低HNRNPA1可以引起MYC及其下游基因的表达抑制,干扰KIF23可以恢复MYC及其下游基因的表达水平。MYC在HNRNPA1调控KIF23可变剪接介导的食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭等恶性表型中发挥重要作用。