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肝癌是全球范围内致死率极高的恶性肿瘤,而中国是肝癌高发地区。miRNA是近年来医学与生物学领域研究的热门方向,其已被证实广泛参与到肿瘤的多种生物进程之中。miRNA是一类长度为18-24 nt的非编码单链RNA,通过结合靶mRNA的3’UTR负调控其转录,从而抑制了靶基因的蛋白表达。近年来,有报道称miR-205为肿瘤抑制因子,在肝癌中呈低表达,然而其分子机制不甚明确。因此,对miR-205在肝癌中所起到抑癌作用的分子机制进行研究有助于阐明肝癌发生发展的过程。本研究具体内容与结果概括如下:1.肝癌细胞中miR-205表达分析与启动子甲基化分析。背景:启动子甲基化修饰可在不改变碱基序列的情况下对下游基因表达调控进行调控。研究miR-205在肝癌细胞中表达差异的现象是否与启动子甲基化修饰相关,初步探讨miR-205上游调控机制以及研究miR-205在肝癌发生发展中所起的作用有重要意义。目的:检测一种肝细胞系与三种肝癌细胞系以及肝癌病人癌组织与癌旁组织中miR-205的表达,并研究该差异与启动子甲基化水平是否相关。方法:通过荧光定量PCR分别检测肝细胞系HL-7702,肝癌细胞系HepG2,BEL-7404,SMMC-7721以及30例肝癌病人癌组织与癌旁组织中miR-205的表达水平。分别对HL-7702,HepG2,BEL-7404细胞系与病人组织标本的其中16例进行重亚硫酸盐测序(Bisulfite Sequencing PCR,BSP)。使用甲基化转移酶抑制剂5-Aza-CdR处理HepG2细胞对其甲基化水平进行抑制,并检测不同浓度的抑制剂对HepG2细胞的miR-205的表达是否产生影响。结果:肝癌标本中癌组织miR-205表达水平低于癌旁组织,肝癌细胞系HepG2,BEL-7404中miR-205表达水平低于正常肝细胞系HL-7702,SMMC-7721中miR-205表达水平与HL-7702无统计学差异。肝癌细胞系HepG2,BEL-7404启动子甲基化水平分别为70%,73.33%,HL-7702启动子甲基化水平为46.67%,病人离体标本癌组织甲基化水平为66.67%,癌旁组织甲基化水平为40%。统计16例病人离体组织甲基化水平发现标本病理分级越高,分化程度越低,启动子甲基化水平越高。5-Aza-CdR处理HepG2细胞可提高miR-205表达,并且处理浓度越高,miR-205表达量越高。结论:肝癌细胞中miR-205基因受启动子高甲基化而抑制其基因表达,并且甲基化程度越高,其肝癌组织恶性程度越高。2.miR-205的靶基因筛选与鉴定。背景:蛋白质是生命活动的主要物质,miRNA是通过对靶mRNA的负调控作用,抑制靶基因的蛋白表达。钓取miR-205的靶基因并进行鉴定,是揭开miR-205参与肝癌细胞分子通路的第一步。目的:筛选肝癌细胞中miR-205的靶基因并进行鉴定,检测其在病人离体标本中的表达水平。方法:通过hybrid PCR法结合生物信息学分析,获取候选靶基因RNF43。通过双荧光素酶报告基因实验证明miR-205靶向结合RNF43 mRNA的3’UTR区域。进一步用荧光定量PCR与Western blot考察miR-205对RNF43在mRNA和蛋白水平的调控作用。免疫组织化学检测RNF43在肝癌病人离体标本癌组织与癌旁组织的表达水平。结果:hybrid PCR法结合生物信息学筛选出6个候选靶基因。双荧光素酶报告基因实验证实miR-205能抑制整合RNF43的mRNA3’UTR结合位点的报告基因载体的表达。荧光定量PCR证实miR-205上调不能抑制RNF43 mRNA的表达,但WB证实miR-205上调可抑制RNF43蛋白的表达,证明miR-205发挥转录抑制的特点。免疫组织化学结果证明肝癌病人标本中癌组织RNF43表达水平高于癌旁组织。结论:RNF43为miR-205的靶基因,并在肝癌中表达升高。3.miR-205/RNF43调控肝癌细胞增殖机制的初步研究。背景:miR-205可抑制肿瘤细胞的增殖,并引起细胞周期阻滞。细胞周期是影响细胞生长的重要因素,研究miR-205/RNF43参与到细胞周期的调控有助于进一步揭示miR-205对肝癌细胞生长抑制的分子机制,并为针对该分子机制进行靶向药物研究提供了理论基础。目的:初步探索肝癌细胞中miR-205/RNF43抑制细胞增殖的分子机制。方法:集落形成实验检测miR-205与RNF43对细胞生长能力的影响。细胞周期分析检测miR-205与RNF43对细胞周期的影响。荧光定量PCR检测miR-205与RNF43对细胞周期检查点蛋白p53,p21与Cyclin E mRNA表达水平的影响。WB检测miR-205与RNF43对细胞周期检查点蛋白p53,p21,CyclinE蛋白表达水平的影响。联合免疫共沉淀(Co-IP)实验检测RNF43蛋白与p53蛋白之间是否有相互作用,泛素化WB检测RNF43蛋白是否促进p53蛋白的泛素化降解。建立裸鼠HepG2移植瘤动物模型,通过瘤内注射miR-205或RNF43表达载体,研究各处理是否影响裸鼠移植瘤的生长。结果:集落形成实验证明miR-205可抑制HepG2细胞的生长,RNF43可解除miR-205对HepG2细胞的生长抑制作用。细胞周期分析证明miR-205可使HepG2细胞周期发生G1期阻滞,RNF43可解除miR-205对HepG2细胞的影响。荧光定量PCR与WB实验证实miR-205对p53,p21基因在mRNA与蛋白水平产生促进表达作用,对CyclinE基因产生抑制表达作用,然而,同时过表达RNF43能拮抗上述效果。miR-205可抑制HepG2细胞裸鼠移植瘤模型肿瘤的生长,RNF43可逆转miR-205对移植瘤生长抑制的作用。结论:miR-205/RNF43通过调控p53,p21,CyclinE参与肿瘤细胞的细胞周期进程,影响了肿瘤细胞的生长。