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【研究背景】脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是康复医学科临床上的常见病和多发病,脊髓损伤后对中枢神经系统有广泛的损伤。脊髓损伤经常导致严重的神经症状,如损伤平面以下不同程度的瘫痪,感觉异常,泌尿系统疾患和其他进行性神经异常等。脊髓损伤还涉及到社会经济负担,有统计数据表明西方发达国家政府需要为每位患者花费的费用大约在4万-18万美元(根据脊髓损伤的部位不同)。还不包括脊髓损伤后患者丧失劳动能力,接受手术及药物治疗、康复治疗、护理等方面的费用,所以政府需要为每个脊髓损伤的患者花费数百万美元。脊髓损伤的病理生理过程一般分为原发性损伤阶段和继发性损伤阶段。原发性损伤发生在脊髓初始损伤后不久,其病理过程主要表现为脊髓脱髓鞘、神经元和轴突坏死。继发性损伤贯穿疾病的全过程,其病理过程主要表现为脱髓鞘、轴突和神经元坏死、神经组织缺血水肿、氧化应激、炎症反应、胶质瘢痕形成等。脊髓损伤引起病变周围神经胶质细胞明显改变其表型和活性。尽管脊髓星形胶质细胞可以调节神经递质可用性和血流,但脊髓损伤后反应性星形胶质细胞形成瘢痕,限制病变的扩张和轴突再生。然而通过扫描健康脊髓中的小胶质细胞的病原体和控制突触的密度,发现脊髓损伤后,小胶质细胞可以促进可塑性,但也会在长时间内过度激活,从而加重损伤。小胶质细胞激活增加炎性细胞因子白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)与肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)的释放。这两种细胞因子被认为是脊髓损伤后炎症反应的关键炎症介质。核因子κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)是一种转录因子,参与多种过程尤其是免疫和炎症反应。NF-κB通路的激活依赖于IL-6、TNF-α和其他炎症因子的分泌,而TNF-α和其他炎症因子受模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)如toll样受体影响。先前的研究发现,NF-κB/toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)参与小胶质细胞在创伤性损伤中的炎症和免疫反应。髓系细胞触发受体2(triggering receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2)是TREM免疫受体家族的一员,与多种神经退行性疾病相关。例如,有研究发现TREM2是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的一个危险因素。此外,TREM2通常在中枢神经系统的小胶质细胞上表达。此外,TREM2的一个变种被发现与ALS的高风险相关。然而,TREM2在外伤性脊髓损伤中的作用至今尚不清楚。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是TLR4的配体,也是一种细菌内毒素,引起组织损伤和感染,从而激活巨噬细胞,模仿创伤后感染。小胶质细胞是一种存在于大脑和脊髓中巨噬细胞,约占免疫系统所有胶质细胞和功能的10%-20%。有报道显示,小胶质细胞的过度激活和增殖是炎症反应的一个重要表现,并导致连续释放IL-6和TNF-α,这与外伤性脊髓损伤后体内的炎性反应类似。【研究目的】探讨TREM2在脊髓损伤后的可能作用机制,以及TREM2在脂多糖诱导的原代小胶质细胞中的作用及其机制。【研究方法】1.体外培养BV2细胞,并给予不同浓度的LPS处理BV2细胞,Western blot检测24h时TREM2的表达,ELISA检测12h和24h细胞上清中TREM2、IL-6和TNF-α的表达。2.TREM2基因干扰慢病毒干预5ug/m L的LPS处理BV2细胞,Western blot检测24h时TREM2的表达,Western blot检测3h时NF-kb和P-NF-kb的表达,ELISA检测24h细胞上清中IL-6和TNF-α的表达。3.TREM2基因过表达慢病毒转染BV2细胞同时用NF-kb抑制剂PDTC处理,ELISA检测24h细胞上清中IL-6和TNF-α的表达。4.构建TREM2干扰和过表达慢病毒转染BV2细胞,Q-PCR和Western blot检测TREM2干扰和过表达效率。5.ELISA检测40例外伤脊髓损伤患者和40例健康人外周血中TREM2、IL-6和TNF-α的表达。【实验结果】1.用酶联免疫吸附测定(enzume-linked immune sorbent assay,ELISA)法测定40例外伤性脊髓损伤患者和40例正常受试者的外周血标本中TREM2、IL-6、TNF-α的浓度,发现外伤性脊髓损伤患者的外周血中的TREM2浓度显著高于正常受试组;IL-6和TNF-α的浓度也高于正常受试组。2.本研究中使用不同的LPS浓度(0、1、5、10ug/m L)来选择刺激培养BV2细胞、小胶质细胞24小时,随后通过TREM2定量的蛋白Western blot检测,显示当用LPS浓度为5 ug/m L诱导时,TREM2的浓度达到最高值;此外用ELISA法测定TREM2、IL-6、TNF-α的浓度,发现上清液中TREM2、IL-6和TNF-α的浓度也显著升高。所以我们选择5 ug/m L的LPS浓度来建立外伤性脊髓损伤模型。3.通过构建TREM2干扰和过表达慢病毒转染BV2细胞,采用RT-PCR检查TREM2的m RNA表达,Western blot检测TREM2的蛋白表达,发现在使用三种受TREM2干扰的慢病毒中,TREM2的m RNA和蛋白表达明显降低,其中si TREM2-1的影响最为明显;另一方面,在TREM2过表达的慢病毒中,TREM2的m RNA和蛋白表达也明显升高。4.下调TREM2对LPS诱导的TREM2表达和p-NF-κB有抑制作用;p-NF-κB、IL-6和TNF-α的浓度与TREM2的表达呈正相关。5.通过BV2细胞的TREM2过表达,研究NF-κB在IL-6、TNF-α、PDTC以及NF-κB抑制剂释放的影响;发现在TREM2过表达时,PDTC的加入降低了IL-6和TNF-α的浓度;证明抑制NF-κB可以抑制BV2细胞中IL-6和TNF-α的释放。【结论】本研究发现,下调TREM2的表达可以抑制LPS刺激的原代小胶质细胞释放炎症因子IL-6和TNF-α,是通过抑制NF-κB信号通路来实现的,表明TREM2/NF-κB通路可能在我们治疗脊髓损伤过程提供一种新的方法。