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微生态制剂是在微生态学理论指导下,运用微生态学原理,利用对宿主有益无害且活的正常微生物或正常微生物的促生长物质,及特殊工艺制成的制剂。其应用前景广阔,在防止肠道疾病方面不仅安全无害、无残留、不产生抗药性,还有提高饲料利用率、促进动物生长、改善产品品质等作用。目前对微生态制剂的研究越来越多,其显著效果吸引了许多专家的注意,很多厂家公司也投入了大量的物力人力财力来充分挖掘其对畜牧养殖业发展的潜力。但与发达国家相比还有较大差距。因此展开微生态制剂的选育和生物技术的研究,提高国内生产技术,缩短与发达国家间的差距,就显得非常重要和紧迫。
本文在已有的水产养殖微生态制剂EM菌的基础上,从本室已有或购得的微生态菌种(纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆、枯草芽孢杆菌、米曲霉、酿酒酵母)出发,采用亚硝基胍-紫外线、甲磺酸乙酯-紫外线、亚硝基胍-甲磺酸乙酯-紫外线等多种不同复合诱变方法对出发菌株进行诱变,在不同pH梯度和含有不同浓度胆盐的抗性培养基上筛选获得适合禽畜胃和肠道环境的耐酸、耐胆盐菌种(耐pH3.5、耐胆酸盐0.1%~0.2%),以补充原来EM菌中缺乏的微生物,扩大其微生物种类,使其达到国内外先进水平。
利用单次单因子法、Plackett-Burman法等现代生物过程优化技术,建立不同种类微生物为优势菌的培养基组分和培养条件。分别确定了各菌种单独培养的最佳培养条件,EM菌最佳培养基为酵母膏3.13%、葡萄糖1.5%、NaAc0.63%、KH2PO40.2%、MgSO40.05%、MnSO40.025%、pH6.0。同时优化了芽孢杆菌的培养基和培养条件,酵母膏0.5%、牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、NaCl1%、MnSO40.75%、MgSO40.05%、K2HPO40.2%、KH2PO40.2%、pH8,接种量2%,溶氧50%(50ml/100ml),此条件下培养48h,B.cereus细胞浓度达到8.2×1013cfu/ml,芽孢率97.5%,B.natto细胞浓度达到9.5×1013cfu/ml,芽孢率92.6%,B.licheniformis细胞浓度达到2.4×1013cfu/ml,芽孢率90%,B.subtilis细胞浓度达到8.6×1012cfu/ml,芽孢率88%。
研究了以上各微生物菌种(豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆、枯草芽孢杆菌、米曲霉、酿酒酵母、灰色链霉菌、屎肠球菌)之间的拮抗性,发现各菌种间不存在拮抗性,可进行下一步混合培养。
在上一步研究的基础上,根据菌种生长速度、温度、溶氧、pH等条件确定不同微生物的接种比列,混合培养。并以各菌种(1%接种量)纯培养为对照,开展多菌种混合培养的研究。最终确定了以下2种微生态剂型:微生态制剂Ⅰ型(厌氧型):以EM菌为主,辅以酿酒酵母、屎肠球菌、丙酮丁醇梭杆菌,培养后检测生物量可达到6.32×1011;微生态制剂Ⅱ型(耗氧性):以芽孢杆菌为主,辅以酿酒酵母、灰色链霉菌、米曲霉、屎肠球菌,培养后检测其生物量可达到8.35×1011。
最后研究不同的保护剂对微生态制剂的保质期,经研究发现海藻糖作为保护剂效果最好,微生态制剂Ⅰ和Ⅱ在30g/L的海藻糖存在下,37℃下30天存活率分别为69.25%和71.46%。