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本文利用Naoki Takaya〔1〕的分离方法,从鱼塘中成功分离到一株高效的有氧反硝化菌,经生理生化初步鉴定为枯草芽孢杆菌,该菌株具有较强的好氧反硝化作用。进一步研究表明在溶解氧(OD)达到2mg/L时,该菌的除氮率达97%,当OD达到4-5mg/L,仍有一定的反硝化作用。与报道的典型的好氧反硝化菌Pseudomonas stutzeri[2]相比,有更强的耐溶解氧的优势。同时本文初步探讨了水体中不同溶解氧、碳源、pH、温度对该芽孢杆菌W2菌株反硝化作用的影响, 实验表明:水体中存在一定量有机碳源有利于反硝化,当以葡萄糖为碳源、pH为7.0-7.5,温度为32℃时,W2菌株具有最佳的降解人工废水反硝化能力。
本文进一步进行了反硝化酶的研究,克隆表达了铜绿假单胞菌的亚硝酸还原酶基因。根据Genbank中的铜绿假单孢菌nirS的基因进行引物设计,通过PCR扩增该基因,并构建原核表达质粒PET28a-nirS,得到的转化子经过PCR鉴定和酶切分析以及测序分析,结果表明,得到的重组子含有nirS基因,而且nirS基因的碱基序列完全正确。然后,将经过鉴定的完全正确的阳性克隆,转化入BL21表达菌,用IPTG诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析柱纯化,SDS-PAGE检测为单条条带,大小为60kDa,并进一步鉴定活性,为进一步研究该蛋白和打开反硝化酶制剂市场奠定基础。