刺激外耳道或耳甲区激活迷走神经耳支引起耳-心反射、耳-肺反射,类似于副交感紧张效应的临床报道很多。本课题前期的研究结果从形态学、电生理学、生物化学等方面证实了耳甲到孤束核(nucleus of solitary tract,NTS)的纤维投射,电针耳甲还可以通过激活NTS神经元的放电来增强副交感的效应,如降低血压、降低血糖、增强胃运动等。癫痫是一种由不同因素引起的以反复发作性大脑功能失调为表现的神经系统疾病。自美国FDA于1997年7月正式批准迷走神经刺激(vagus nervestimulation,VNS)疗法作为12岁以上药物难治性部分发作性癫痫的一种辅助疗法以来,这种治疗方法被全世界范围患者所应用。虽然其作用机制仍不是十分清楚,多数的观点认为VNS可能是通过激活迷走神经投射到NTS的通路,然后通过NTS与脑内的广泛联系达到去同步化脑电,抑制癫痫的目的。已有研究提示,癫痫的发病可能与自主神经系统功能的失调有关,表现为交感神经系统功能的亢进,副交感神经系统功能低下。VNS则可能通过刺激迷走神经增强副交感的效应而抑制癫痫。有研究报道在颈部运用经皮迷走神经电刺激治疗癫痫取得疗效,而且经皮刺激迷走神经耳支支配的耳甲区也可以治疗癫痫,中医耳针治疗癫痫选穴也以耳甲区的穴位为主。由此,我们设想,耳针可能通过刺激迷走神经耳支发挥抑制癫痫的效应。本研究从行为学、电生理学等角度分别观察了耳针对癫痫大鼠行为学表现,NTS神经元放电,硬膜外脑电图(electroencephalogram,EEG)的影响,以及局部冷冻NTS对耳针抗癫痫效应的影响,和应用交感兴奋剂、拮抗剂对癫痫大鼠EEG的影响,试图从耳-迷走反射的角度探讨耳针抑制癫痫的作用机制。一动物实验实验1耳针预处理对戊四氮致癫痫大鼠行为学表现的影响1.1实验动物健康成年Sprague-Dawley雄性大鼠42只,体重300±28g,由中国医学科学院实验动物中心提供,清洁级。1.2实验过程将动物分为3组。模型组(n=14)给予大鼠腹腔注射戊四氮(pentylenetetrazol,PTZ)60 mg/kg造成急性癫痫模型,后观察30 min大鼠行为学的表现,耳甲治疗组(n=15)和大椎治疗组(n=13)分别在造模前电针耳甲或“大椎”穴30 min,后立即腹腔注射PTZ,观察30 min大鼠行为学的表现。行为学表现根据Racine分级标准进行评分。电针刺激参数:强度,1 mA;频率,20 Hz;脉宽,500μs;刺激30 s,间隔5 min,持续30 min。1.3实验结果模型组大鼠腹腔注射PTZ 40s左右出现癫痫发作,开始表现为小发作,如凝视,点头运动,双前肢抬起,阵挛等,1-2 min出现大发作,表现为后肢伸直,抽搐,跌倒伴翻滚,持续约9.5 s,PTZ后30 min内大鼠有1-2次大发作,多次小发作。与模型组比较,大椎治疗组和耳甲治疗组动物大发作潜伏期(即从腹腔注射PTZ到大鼠出现第一次大发作的时间)延长(P＜0.05,P＜0.01),行为学评分减少(P＜0.05,P＜0.01)。与大椎治疗组比较,除了在首次大发作持续时间上无显著差异(P＞0.05),耳甲治疗组大发作潜伏期延长(P＜0.01),行为学评分亦减少(P＜0.01)。结果提示:针刺预处理可以抑制大鼠癫痫发作,而且电针耳甲抑制癫痫的效应优于电针“大椎”穴的效应。实验2耳针对癫痫大鼠孤束核神经元细胞外放电和脑电图的影响2.1实验动物健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠45只,体重300±34g,清洁级,由中国医学科学院实验动物中心提供。2.2实验过程手术及实验过程中动物体温用计算机温度时间控制仪维持在37℃。大鼠麻醉后仰卧,颈部正中切口,游离左侧迷走神经干1cm,将自制C型双极银质电极刺激端无张力地钩于迷走神经干上用以刺激迷走神经,缝合伤口。然后俯卧,将大鼠头部用耳棒固定于脑立体定位仪上,根据大鼠脑立体定位图谱(Paxinos和Watson,1998),在前囟前(A:1.0 mm,L:1.0 mm)和前囟后(A:-1.0 mm,L:1.0 mm)及NTS(A:-11.3～-14.3 mm,L:0～2.3 mm,H:4～7 mm)对应颅骨表面,用颅骨钻钻孔,暴露硬脑膜。双银球电极置于前囟前、后各一小孔内硬脑膜上用以记录EEG。显微镜下分离NTS对应处小孔硬脑膜和软脑膜,暴露小脑皮层,玻璃微电极(阻抗10-20 MQ)记录NTS神经元放电。手术完毕一小时待大鼠状态稳定后开始记录。用微推进器推进玻璃微电极寻找到自发放电的NTS神经元,上下调节推进器位置,至信噪比较大时停止推进。记录30 s背景放电,待细胞放电频率稳定后,给予耳甲刺激15 s,若细胞放电频率出现变化,确定为对耳甲刺激有反应神经元。在细胞放电频率稳定后,给予大鼠腹腔注射PTZ(40-60 mg/kg)造模,以造模后5 min内EEG出现高幅的癫痫波为造模成功。分别观察造模前后,刺激迷走神经(vagus nerve,VN)、耳甲腔、耳甲艇、耳尖、耳郭外缘中点、耳垂、“大椎”穴、“丰隆”穴前后NTS神经元放电频率和EEG的变化。每一次操作在EEG恢复稳定后重复刺激程序,一只动物每组穴位刺激最多重复3次。刺激方法包括经皮电刺激(transcutaneous electrical nerve stimulation,TENS),电针刺激(electroacupuncture,EA)或手针刺激(manual acupuncture,MA)。TENS或EA参数:强度,1 mA;频率,20 Hz;脉宽,500μs;刺激30 s,间隔5 min,持续30 min。MA采用平补平泻,均匀捻转。针刺时间,30 s。2.3实验结果2.3.1造模前后孤束核神经元放电频率和脑电图的同步变化造模前后共观察到31个细胞。造模后26个细胞放电频率降低(83.87%),3个细胞放电频率不变(9.68%),2个细胞放电频率增多(6.45%)。经统计学处理:NTS细胞放电频率造模前为9.48±0.76个/秒,造模后为4.69±0.36个/秒。其中26个放电频率降低的细胞,其放电频率的变化和脑电图的变化存在同步性,即在细胞放电频率降低时,EEG出现高幅癫痫波,当细胞放电频率增加时,EEG癫痫波消失或振幅降低。说明当NTS细胞放电频率减少时,动物癫痫发作,NTS细胞放电频率增多时,癫痫的发作消失或减少。这种同步变化在造模后1-3分钟之内开始出现,呈节律性变化,按EEG每出现一次癫痫波记为一次癫痫发作,最初发作3次/分,2秒/次,约7-10分钟内持续增多,在约15分钟后,呈基本有规律的变化,平均发作约6.21±0.48次/分,持续时间4.32±0.23秒/次,每分钟发作总的持续时间为26.83±2.25秒。2.3.2 TENS对NTS放电频率影响的统计结果TENS(n=31)后,放电频率从平均4.53±0.35个/秒增加到7.50±0.63个/秒,增加了2.97±0.18个/秒(P＜0.01);刺激耳甲腔(n=29)后,放电频率从4.66±0.41个/秒增加到7.64±0.72个/秒,增加了2.98±0.14个/秒(P＜0.01);刺激耳甲艇(n=32)后,放电频率从4.71±0.38个/秒增加到7.61±0.62个/秒,增加了2.90±0.15个/秒(P＜0.01);刺激耳垂(n=28)后,放电频率从4.69±0.48个/秒增加到5.72±0.56个/秒,增加了1.03±0.08个/秒(P＜0.01);刺激耳郭外缘中点(n=26)后,放电频率从4.72±0.34个/秒增加到5.40±0.42个/秒,增加了0.68±0.04个/秒(P＜0.05);刺激耳尖(n=25)后,放电频率从4.59±0.31个/秒增加到5.42±0.53个/秒,增加了0.83±0.05个/秒(P＜0.05);刺激“大椎”(n=28)后,放电频率从4.67±0.34个/秒增加到5.23±0.28个/秒,增加了0.56±0.06个/秒(P＜0.05);刺激“丰隆”(n=20)后,放电频率从4.82±0.49个/秒增加到5.08±0.38个/秒,增加了0.26±0.03个/秒(P＞0.05)。结果:除了“丰隆”穴,TENS其他部位前后NTS放电频率比较,差异有统计学意义。2.3.3 EA对NTS放电频率影响的统计结果VNS(n=26)后,放电频率从4.63±0.39个/秒增加到8.25±0.43个/秒,增加了3.62±0.25个/秒(P＜0.01);刺激耳甲腔(n=25)后,放电频率从4.59±0.54个/秒增加到8.18±0.61个/秒,增加了3.59±0.34个/秒(P＜0.01);刺激耳甲艇(n=27)后,放电频率从4.58±0.46个/秒增加到8.19±0.62个/秒,增加了3.61±0.14个/秒(P＜0.01);刺激耳垂(n=24)后,放电频率从4.73±0.45个/秒增加到5.85±0.64个/秒,增加了1.12±0.09个/秒(P＜0.01);刺激耳郭外缘中点(n=22)后,放电频率从4.65±0.24个/秒增加到5.51±0.59个/秒,增加了0.86±0.07个/秒(P＜0.01);刺激耳尖(n=25)后,放电频率从4.59±0.48个/秒增加到5.60±0.54个/秒,增加了1.01±0.09个/秒(P＜0.01);刺激“大椎”(n=20)后,放电频率从4.65±0.34个/秒增加到5.31±0.32个/秒,增加了0.66±0.07个/秒(P＜0.05);刺激“丰隆”(n=21)后,放电频率从4.56±0.49个/秒增加到4.91±0.55个/秒,增加了0.35±0.05个/秒(P＞0.05)。结果,除了“丰隆”穴,电针其他部位前后NTS放电频率比较,差异有统计学意义。2.3.4 MA对NTS放电频率影响的统计结果刺激耳甲腔(n=28)后,放电频率从4.68±0.46个/秒增加到8.52±0.74个/秒,增加了3.84±0.35个/秒(P＜0.01);刺激耳甲艇(n=32)后,放电频率从4.72±0.57个/秒增加到8.53±0.75个/秒,增加了3.81±0.45个/秒(P＜0.01);刺激耳垂(n=33)后,放电频率从4.61±0.43个/秒增加到6.00±0.52个/秒,增加了1.39±0.17个/秒(P＜0.01);刺激耳郭外缘中点(n=29)后,放电频率从4.65±0.58个/秒增加到5.63±0.55个/秒,增加了0.98±0.12个/秒(P＜0.01);刺激耳尖(n=26)后,放电频率从4.61±0.35个/秒增加到5.87±0.43个/秒,增加了1.21±0.15个/秒(P＜0.01);刺激“大椎”(n=25)后,放电频率从4.62±0.59个/秒增加到5.33±0.37个/秒,增加了0.91±0.12个/秒(P＜0.01);刺激“丰隆”(n=20)后,放电频率从4.65±0.30个/秒增加到5.15±0.59个/秒,增加了0.50±0.06个/秒(P＜0.05)。结果,手针每个部位前后NTS放电频率比较,差异都有统计学意义。2.3.5不同针刺方法不同部位刺激对NTS神经元放电频率影响的比较同一刺激部位,不同方法刺激前后NTS神经元放电频率的差值比较:MA与TENS、EA相比,差异有统计学意义(P＜0.05),EA与TENS相比,差异有统计学意义(P＜0.05),说明增加NTS神经元放电频率的效应比较,MA较TENS、EA显著,EA较TENS显著。同一刺激方法,不同部位刺激前后NTS神经元放电频率的差值比较:VNS、耳甲腔、耳甲艇分别与其他部位相比,差异有统计学意义(P＜0.01),VNS、耳甲腔、耳甲艇两两相比,差异没有统计学意义(P＞0.05),说明刺激VNS、耳甲腔、耳甲艇增加NTS神经元放电频率的效应较刺激其他部位的效应显著,而且与VNS相比无显著差异。2.3.6不同针刺方法不同部位刺激对EEG影响的比较同一刺激部位,不同方法刺激前后大鼠癫痫发作持续时间的差值比较:MA与TENS、EA相比,差异有统计学意义(P＜0.05),EA与TENS相比,差异有统计学意义(P＜0.05),说明抑制癫痫的效应比较,MA优于EA和TENS,EA优于TENS。同一刺激方法,不同部位刺激前后大鼠癫痫发作持续时间的差值比较:VNS、耳甲腔、耳甲艇分别与其他部位相比,差异有统计学意义(P＜0.01),VNS、耳甲腔、耳甲艇三者两两比较,差异没有统计学意义(P＞0.05),说明刺激VNS、耳甲腔、耳甲艇抑制癫痫的效应优于刺激其他部位的效应。实验3耳针对癫痫大鼠行为学表现、孤束核场电位、皮层场电位的影响3.1实验动物:健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠124只,体重298±31g,清洁级,由中国医学科学院实验动物中心提供。3.2实验过程3.2.1单电极记录耳针对癫痫大鼠皮层场电位的影响(急性实验)手术过程中动物体温用计算机温度时间控制仪维持在37℃。大鼠12只,麻醉后俯卧。根据大鼠脑立体定位图谱,暴露初级体感皮层(SI)(A:-3～-6 mm;L:4～6 mm:H:1.5 mm),用单根直径为50μ的金属微电极记录癫痫大鼠SI场电位(FPs),分别观察5个部位耳针(包括耳甲腔、耳甲艇、耳垂、耳郭外缘中点、耳尖)30 s前后癫痫大鼠SI FPs的变化。电针刺激参数:强度,1 mA;频率,20 Hz;脉宽,500μs;刺激30 s。3.2.2单电极记录耳针对癫痫大鼠行为学表现、皮层场电位影响(慢性实验)大鼠50只,根据外耳5个刺激部位分为5组,每组10只。手术前部分同3.2.1,将金属微电极推进至SI后,牙托水泥固定电极,动物清醒并恢复一周后,分别观察5个部位耳针30 min后癫痫大鼠行为学表现和SI FPs的变化。电针刺激参数:强度,1 mA;频率,20 Hz;脉宽,500μs;刺激30 s,间隔5 min,持续30 min。3.2.3微电极阵列记录耳针对癫痫大鼠孤束核场电位、皮层场电位的影响(急性实验)手术过程中动物体温用计算机温度时间控制仪维持在37℃。大鼠12只,根据大鼠脑立体定位图谱,用微电极推进器将两组微电极阵列(MEA)推进至NTS(电极类型:2×2)和SI(电极类型:2×8),分别记录NTS FPs和SI FPs,分别观察5个部位耳针30 s前后NTS FPs和SI FPs的变化。电针刺激参数同3.2.1。3.2.4微阵记录耳针对癫痫大鼠行为学表现、皮层场电位影响(慢性实验)大鼠50只,根据外耳5个刺激部位分为5组,每组10只。手术前部分同3.2.3,将MEA推进至SI(电极类型:2×8)后,牙托水泥固定电极,动物清醒并恢复一周后,分别观察5个部位耳针30 min后大鼠行为学表现和SI FPs的变化。电针刺激参数同3.2.2。3.3实验结果3.3.1单电极记录耳针对癫痫大鼠皮层场电位的影响(急性实验)电针耳甲腔(n=14)后,发作持续时间从26.15±2.31秒减少到5.07±0.64秒,减少了21.08±2.06秒(P＜0.01);电针耳甲艇(n=13)后,发作持续时间从25.98±2.17秒减少到4.97±0.43秒,减少了21.01±1.97秒(P＜0.01);电针耳垂(n=13)后,发作持续时间从26.29±2.24秒减少到19.28±1.53秒,减少了7.01±0.82秒(P＜0.01);电针耳郭外缘中点(n=11)后,发作持续时间从26.38±2.37秒减少到22.16±1.98秒,减少了4.02±0.35秒(P＜0.01);电针耳尖(n=10)后,发作持续时间从26.41±2.23秒减少到19.78±1.62秒,减少了6.63±0.47秒(P＜0.01)。每个部位电针前后大鼠癫痫发作总的持续时间比较,差异有统计学意义,说明耳针能明显抑制大鼠癫痫发作。3.3.2单电极记录耳针对癫痫大鼠行为学积分、皮层场电位的影响(慢性实验)耳针后行为学积分比较:电针耳甲腔、电针耳甲艇组分别与其它组相比,差异有统计学意义(P＜0.01);电针耳甲腔与电针耳甲艇比较,差异没有统计学意义(P＞0.05)。耳针后FPs记录的癫痫发作持续时间比较:电针耳甲腔、电针耳甲艇分别与其它组相比,差异有统计学意义(P＜0.01);电针耳甲腔与电针耳甲艇比较,差异没有统计学意义(P＞0.05)。说明电针耳甲抑制癫痫的效应优于电针其它耳部的效应。3.3.3微电极阵列记录耳针对癫痫大鼠孤束核场电位、皮层场电位的影响(急性实验)电针耳甲腔(n=12)后,发作持续时间从25.94±2.12秒减少到4.91±0.37秒,减少了21.03±1.96秒(P＜0.01);电针耳甲艇(n=13)后,发作持续时间从26.29±2.40秒减少到5.02±0.38秒,减少了21.27±2.01秒(P＜0.01);电针耳垂(n=10)后,发作持续时间从26.42±3.01秒减少到19.20±2.02秒,减少了7.22±0.69秒(P＜0.01);电针耳郭外缘中点(n=10)后,发作持续时间从26.61±3.12秒减少到21.60±2.05秒,减少了5.01±0.36秒(P＜0.01);电针耳尖(n=10)后,发作持续时间从25.74±2.23秒减少到18.41±1.62秒,减少了6.93±0.52秒(P＜0.01)。每个部位电针前后大鼠癫痫发作总的持续时间比较,差异有统计学意义(P＜0.01),说明耳针能明显抑制大鼠癫痫发作。而且MEA记录显示癫痫大鼠NTS FPs与SI FPs电位振幅的变化同步。3.3.4微电极阵列记录耳针对癫痫大鼠行为学积分、皮层场电位的影响(慢性实验)耳针后行为学积分比较:电针耳甲腔组、电针耳甲艇组分别与其它组相比,差异有统计学意义(P＜0.01);电针耳甲腔组与电针耳甲艇比较,差异没有统计学意义(P＞0.05)。耳针后FPs记录的癫痫发作持续时间比较:电针耳甲腔组、电针耳甲艇组分别与其它组相比,差异有统计学意义(P＜0.01);电针耳甲腔组与电针耳甲艇组比较,差异没有统计学意义(P＞0.05)。说明电针耳甲抑制癫痫的效应优于电针其它耳部的效应。实验4物理冷冻孤束核对耳针抗癫痫效应的影响4.1实验动物健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠10只,体重300±30g,清洁级,由中国医学科学院实验动物中心提供。4.2实验过程手术及实验过程中动物体温用计算机温度时间控制仪维持在37℃。双银球电极记录硬脑膜外EEG。沿大鼠项部正中切开皮肤,充分暴露闩部,并保持闩部水平。将U型管固定于微推进器,用微推器将U型管底部轻轻接触于孤束核在延髓投影区,即闩部区域。将冷冻至-8℃的防冻液用注射器匀速推进通过U型管,局部冷冻孤束核。观察冷冻孤束核对癫痫大鼠EEG的影响,以及对耳针(包括耳甲腔、耳甲艇、耳垂、耳郭外缘中点、耳尖)抑制癫痫EEG效应的影响。4.3结果造模前,孤束核冷冻前、冷冻时、及冷冻后EEG无明显变化。腹腔注射PTZ造模后,同一刺激部位电针前后发作持续时间的差值比较:冷冻NTS中与冷冻NTS前比较,差异有统计学意义(P＜0.01);撤除冷冻NTS 5 min后与冷冻NTS前比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。结果表明冷冻NTS时,耳针抑制癫痫的效应减弱,撤除冷冻5min后,耳针抑制癫痫的效应恢复。说明NTS的功能受损削弱了耳针抗癫痫的效应。实验5静脉注射盐酸肾上腺素,心得安对癫痫大鼠脑电图的影响5.1实验动物健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠10只,体重300±30g,清洁级,由中国医学科学院实验动物中心提供。5.2实验过程手术及实验过程中动物体温用计算机温度时间控制仪维持在37℃。双银球电极记录硬膜外EEG.。股静脉插管,以备静脉用药。造模成功后,给予大鼠股静脉注射盐酸肾上腺素或心得安,观察药物对癫痫大鼠EEG的影响。5.3结果癫痫发作较少时静脉注射肾上腺素,可以加剧癫痫的发作;当癫痫发作频繁时静脉注射心得安,可以抑制癫痫的发作。二结论本项研究从行为学和电生理的角度探讨了耳针治疗癫痫的效应机制。实验结果表明:癫痫的发病表现为行为学发作和脑电图的高幅癫痫波,同时可能伴有自主神经系统功能的失衡。针刺特别是耳针能明显改善癫痫大鼠的行为学表现,这种作用可能通过激活NTS的活动来增强副交感的功能从而去同步化脑电,最终抑制癫痫发作。刺激耳甲的急性抗癫痫效应与VNS的急性抗癫痫效应相比无显著性差异,且明显优于刺激其它部位的效应,可能与耳甲部分布有迷走神经耳支相关。这项研究从行为学和电生理的角度探讨了耳针治疗癫痫的效应机制,不仅为耳针治疗癫痫提供了理论依据,也为耳-迷走理论提供更丰富的依据。同时本研究发现癫痫大鼠NTS的放电频率与EEG癫痫波存在着时间上的同步变化的关系,物理冷冻NTS损削弱了耳针抑制癫痫脑电图的效应,说明NTS可能参与癫痫的发生和发展。这一结果为解释癫痫的发病机制和VNS治疗癫痫的作用机制提供了理论依据。本部分实验还进行了经皮电刺激(TENS)、电针(EA)、手针(MA)三种刺激方法治疗癫痫大鼠的效应的比较,发现MA效果优于EA和TENS,EA效果优于TENS,说明不同刺激方法所产生的效应不同,这项研究结果为临床针灸治疗癫痫选用适宜的方法提供了一定的实验依据。