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玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)是由镰刀菌产生的一种常见的具有类雌激素作用的真菌毒素。ZEA的毒性作用范围广泛,近年来人们发现ZEA可诱导睾丸间质肿瘤的发生,但机制不明。所以,探究ZEA对睾丸间质细胞作用的机制,对揭示ZEA诱导雄性动物睾丸间质细胞肿瘤发生的机理具有重要意义。本试验以TM3细胞(小鼠睾丸间质细胞系)为材料,研究暴露于低浓度ZEA下,TM3细胞增殖和迁移、细胞周期及相关调控蛋白的变化;利用二代高通量测序技术,筛选了差异表达的miRNAs,并利用Parhway分析和GO分析对ZEA诱导TM3细胞肿瘤发生的相关通路和蛋白进行了预测;通过实时定量PCR和免疫印迹法对筛选的miRNA和预测的信号通路相关蛋白进行了验证。1.ZEA对TM3细胞增殖活力及迁移的影响。用不同浓度 ZEA(Oμmol/L、0.01μmol/L、0.02μmol/L、0.03μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L)处理 TM3 细胞 24h,CCK-8 法检测 ZEA 对 TM3 细胞增殖活力影响;利用RTCA细胞实时监测仪,监测不同浓度ZEA(分组同上)对TM3细胞指数的影响;用不同浓度ZEA(Oμmol/L、0.01μmol/L、0.03μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L)处理细胞12h,Transwell试验检测细胞迁移的变化;RTCA 监测暴露在不同浓度 ZEA(0μmol/L、0.01μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L)下,TM3细胞迁移率的变化;以0.01μmol/L浓度的ZEA染毒TM3细胞2h、6h、9h、18h,PI荧光染色法检测TM3细胞周期的变化、免疫印迹法(Western Blot)检测细胞周期调控蛋白Cyclin D1及其激酶Cdk4,Bcl-2基因家族成员的表达情况。结果:与对照组相比,0.05μmol/LZEA以下浓度染毒组细胞相对增殖活力极显著升高(P<0.01),0.1μmol/LZEA染毒组则显著性升高(P<0.05),而0.5μmol/LZEA染毒组差异不显著(P≥0.05);RTCA结果显示,染毒24h(细胞生长至45h)时,各染毒组CI较对照组均升高,但升高幅度随染毒浓度的升高呈下降趋势,0.1μmol/L ZEA以上浓度染毒组与对照组比较CI曲线变化不明显;Transwell结果可见,随着ZEA浓度升高,穿过小室的细胞越多,0.03μmol/L ZEA以下浓度染毒组较对照组差异显著(P<0.05),其余染毒组较对照差异极显著(P<0.01);RTCA监测结果显示,ZEA染毒30h后,0.01μmol/L染毒组迁移指数相比对照组逐渐升高,其余浓度组则变化不明显;PI荧光染色法和免疫印迹法检测结果显示,随着染毒时间的延长,分布于G1/G0期的细胞逐渐减少,向S期和G2期转化,而细胞周期调控蛋白Cyclin D1及其激酶Cdk4蛋白表达量随着染毒时间延长而逐渐上升(P<0.01)。以上结果表明,低浓度的ZEA在一定浓度范围内对TM3细胞的增殖与迁移的能力具有促进作用,选取0.011μmol/L浓度的ZEA作为测序浓度,染毒时间点选为2h、6h、18h。2.ZEA对TM3细胞microRNA表达的影响。用0.01μmol/L浓度ZEA处理TM3细胞Oh、2h、6h、18h,提取样品总RNA,利用Illumina二代高通量测序平台Hiseq 2000进行深度测序分析;利用KEEP和GO分析,预测增殖、迁移相关miRNAs的靶基因与靶蛋白。结果:对照组得到9481806个miRNA读段数、ZEA处理2h得到920676个miRNA读段数、处理6h得到8779706个miRNA读段数、处理18h得到9206769个miRNA的读段数。其长度主要集中在21-24nt,正好是miRNA的典型长度。2h染毒组和正常组对比共有99个miRNA发生变化,其中上调有41个,58个下调;6h和2h染毒组对比有100个miRNA表达存在差异,其中上调miRs有43个,57个下调;18h和6h染毒组对比有138个miRs发生变化,其中49个miRs上调,89个下调;Parhway分析发现,富集值较高的通路共有20条,而GO分析筛选出52个差异条目,其中包含MAPK信号通路、AMPK信号通路多条重要的增殖、迁移相关的信号通路,还包括NF-kappaB炎症反应信号通路。结合测序结果分析,同时查阅大量文献,按照增殖和迁移两大功能分类,筛选出最可能受ZEA影响,调控TM3细胞增殖和迁移的相关5个miRs,及MAPK信号通路相关蛋白。3.高通量测序及靶蛋白预测结果的验证。0.01μmol/LZEA分别处理TM3细胞Oh、2h、6h、18h,提取总RNA,利用实时定量PCR技术检测表达差异的基因Let-7c-5p、miR-7a-5p、miR-10b-5p、miR-1Oa-5p、miR-21a-5p;采用蛋白免疫印迹法,检测 MAPK 信号通路中相关蛋白ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、P38、p-P38,同时检测内参蛋白 p-Actin。结果:样本RNA纯度合格,染毒2h组与对照比,Let-7c-5p、miR-7a-5p、miR-10b-5p、miR-10a-5p表达均下调,而miR-21a-5p表达上调;随着染毒时间增加,miR-21a-5p 和 miR-7a-5p 表达均下调,而 Let-7c-5p、miR-10b-5p 和 miR-10a-5p 的表达均上调,与测序结果一致,具有统计学意义(P<0.05);免疫印迹结果显示,2h无明显变化,但是随着染毒时间增加,JNK磷酸化水平极显著下降(P<0.01);而ERK和P38在2h也无明显变化,随着时间增加其磷酸化水平极显著上升(P<0.01)。ZEA可以使miRNA的表达发生改变,影响MAPK信号通路,从而调节细胞增殖与迁移过程。结论:低剂量ZEA对TM3细胞的增殖与迁移的能力具有促进作用,并可以引起 miR-21a、let-7c-5p、miR-7a-5p、miR-10a-5p、miR-10b-5p 等肿瘤相关 miRNA的表达异常,与MAPK信号通路中细胞增殖与迁移相关蛋白的表达异常。