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目的：1—磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phospate，S1P）、鞘氨醇激酶（sphingosine kinase，SPK）均是细胞增殖及存活的重要信号分子，S1P由SPK磷酸化鞘氨醇（sphingosine，Sp）而成，已经证实SPK／S1P信号途径在某些恶性肿瘤的发生发展中具有重要作用，但对其具体作用机制尚未明确。肝癌为富含血管的肿瘤，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在肝癌中有高表达，对肝癌的生长和转移有重要意义。SPK／S1P信号途径是否具有调节VEGF表达的作用目前国内外均未见报道。本课题应用细胞生物学、分子生物学等方法研究了SPK／S1P信号途径对人肝癌细胞HepG2增殖、凋亡以及对VEGF的影响与作用机制。方法：人肝癌细胞株HepG2培养在含10％新生牛血清的DMEM培养基中，置于5％CO2、饱和湿度、37℃培养箱中传代培养，0.25％胰蛋白酶消化，倒置显微镜观察细胞生长状况。采用对数生长期的细胞进行实验。观察5～20μmoL／L浓度范围DMS（Dimethyl sphingosine，鞘氨醇激酶的特异性抑制剂，N，N’—二甲基鞘氨醇）对HepG2细胞增殖、调亡及分泌VEGF的影响。MTT法（四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）检测细胞的存活率，倒置相差显微镜及扫描电镜观察调亡细胞形态学变化，TUNEL（Terminal deoxynucleotide mediated nick end labeling）法检测细胞的凋亡，双抗体夹心酶联免疫吸附（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法检测对肝癌细胞分泌VEGF的影响，RT-PCR法检测对肝癌细胞分泌VEGFmRNA的影响。结果：1、SPK／S1P信号途径对人肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响。（1）MTT实验结果显示：5～20μmoL／L浓度范围的DMS对细胞增殖均有抑制作用，细胞存活率随作用时间延长和浓度升高而降低。（2）形态学观察：倒置显微镜观察，HepG2细胞体外培养12小时后，对照组细胞呈克隆性生长，细胞呈梭形或多角形；DMS的处理组改变明显，表现为细胞内部颗粒、空泡增多，部分细胞体积变小、形态变圆，细胞膜皱缩，较多细胞从贴壁状态脱落，悬浮于培养液中，随着培养时间的延长和药物浓度的增大，脱落细胞逐渐增多；细胞体积缩小，微绒毛消失，染色质浓聚、边集、裂解，细胞表面凸起多个小泡或小球状小体。透射电镜观察：对照组细胞可见细胞内线粒体、内质网、高尔基体和核糖体等各种细胞器丰富，核仁多见；经DMS作用后的细胞变暗、线粒体、内质网等细胞器数量明显减少，细胞内空泡增多，核内染色体凝聚成粗大染色质，并向核膜靠近，有的已掉到核外，有的已形成凋亡小体。（3）TUNEL标记法检测示：DMS作用12小时后，对照组细胞细胞核呈淡粉色，处理组可见散在分布的细胞核呈棕红色的细胞，细胞质呈较浅着色。对照组阳性细胞表达百分数为（5.89±0.65）％，10μmoL／LDMS处理组阳性细胞表达百分数为（26.31±1.97）％，20μmoL／LDMS处理组阳性细胞表达百分数为（40.24±5.27）％，处理组阳性细胞表达百分数较对照组明显增多（P＜0.01），具有显著性差异。从各组DMS阳性细胞表达百分数来看，20μmoL／LDMS处理组最高，平均DMS阳性细胞表达百分数高出对照组近8倍，10μmoL／LDMS处理组也比正常对照组高出近5倍。2、SPK／S1P信号途径对人肝癌细胞HepG2表达VEGF的影响。（1）双抗体夹心酶联免疫吸附（ELISA）法结果显示：5～20μmoL／LDMS均可使细胞培养上清液中VEGF蛋白含量明显降低，与对照组相比有显著性差异（P＜0.01）。（2）RT-PCR结果显示：从VEGF表达电泳结果可见，随着DMS浓度升高，VEGF表达电泳的电泳条带亮度逐渐减弱，提示mRNA含量逐渐减少；不同浓度DMS处理后的HepG2细胞中VEGF基因表达较对照组明显降低，与对照组相比有显著性差异（P＜0.01）。结论：1、DMS对HepG2细胞的生长增殖具有抑制作用，呈剂量和时间依赖效应，大剂量DMS诱导HepG2细胞凋亡。DMS通过特异性的抑制SPK，使得S1P生成减少，HepG2细胞生长受到抑制，并可能发生凋亡。2、DMS可以通过阻断SPK／S1P信号途径，抑制肝癌细胞合成和分泌VEGF，从而说明阻断SPK／S1P信号途径对人肝癌细胞VEGF分泌具有明显的下调作用。