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背景与目的:膀胱肿瘤是泌尿系最常见的肿瘤之一,大部分膀胱肿瘤组织学类型为膀胱移行细胞癌。膀胱肿瘤的发病率较高、且具有临床难治性,经治疗后易复发等特性。在膀胱肿瘤的诊断、治疗及预后等过程中需要耗费较大财力,给患者及家属带来一定的经济负担,但是膀胱肿瘤恶性生物学机制还需要我们深一步研究。导致膀胱肿瘤发生恶性生物学行为因素多种多样,肿瘤微环境是诱导膀胱癌发生恶性生物学行为的重要环节,然而微环境中膀胱癌的恶性生物学行为还需要更深入的研究。上皮间质转化是肿瘤恶性生物学改变的重要过程,在膀胱肿瘤发生恶转过程中发挥重要作用。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)在肿瘤生长微环境中对肿瘤的侵袭转移起着至关重要的作用,TAM具有M1型和M2型两种重要表型。M1型TAM能够抑制并直接杀伤肿瘤,而M2型TAM能够促进肿瘤的侵袭和转移。在肿瘤微环境中,TAM主要为M2型,导致肿瘤的恶化。基于对两种亚型的TAM功能特点的了解,深入探究肿瘤相关巨噬细胞与肿瘤微环境的关系是目前学术研究的热点,肿瘤微环境也将为肿瘤治疗提供一个行的思路。该文章主要研究目的是探究M2巨噬细胞诱导人膀胱肿瘤细胞EJ、T24产生上皮间质转化(EMT),及NF-κB信号通路在此过程中的调控作用,以及M1巨噬细胞可以抑制NF-kB信号通路来抑制膀胱肿瘤的上皮间质转化。方法:将人单核白血病细胞THP-1暴露于150nM PMA下培养24h,分化为M0型TAMs。以M0巨噬细胞为基础,将M0巨噬细胞培养在含20 ng/ml干扰素(IFN-γ)和10pg/ml脂多糖(LPS)的无血清1640培养液中24h,得到M1型巨噬细胞。同样将M0巨噬细胞暴露在含有20 ng/ml白介素4(IL-4)和20 ng/ml白介素13(IL-13)的无血清培养液中24h,得到M2型巨噬细胞。通过6孔板小室,将膀胱肿瘤细胞T24,EJ培养于下室,将M2巨噬细胞种于上室。显微镜观察M2巨噬细胞共培养后T24,EJ细胞的形态变化;细胞划痕实验验证经过M2巨噬细胞共培养后膀胱肿瘤细胞转移能力变化;使用transwell实验检测M2巨噬细胞共培养后膀胱肿瘤细胞侵袭能力的增加;我们应用Western blot和RT-PCR方法证实膀胱肿瘤细胞的上皮标志物以及间质标志物相关蛋白及RNA含量变化;使用NF-κB通路的特异性抑制剂PDTC及M1巨噬细胞与膀胱肿瘤细胞共培养,观察膀胱上皮细胞形态及分子水平变化。结果:(1)PMA刺激THP-1单核细胞24h后,细胞形态由原来的单核悬浮状态变成贴壁细胞,并长出触角,高表达巨噬细胞标志物CD36,CD68,CD71,低表达单核细胞标志物CD14,得到M0巨噬细胞。将M0型巨噬细胞暴露在含20 ng/ml IFN-γ和10pg/ml LPS的培养液中24h,得到M1型巨噬细胞,高表达IL-6,IL-1β,TNF-α,CXCL-10。将M0巨噬细胞培养在含有20 ng/ml白介素4和20 ng/ml白介素13的培养液中24h,得到M2型巨噬细胞,高表达CD163,CD206,IL-10,Arg-1。(2)M2巨噬细胞与膀胱肿瘤细胞EJ,T24共培养,肿瘤细胞的细胞间距以及细胞形态发生较大改变,细胞伪足在部分细胞中产生。细胞划痕实验验证共培养处理EJ,T24细胞的细胞转移能力明显增强。Transwell实验证明EJ,T24的侵袭能力在M2巨噬细胞共培养处理后得到增强。M2巨噬细胞共培养后的肿瘤细胞上皮间质转化特异分子的表达水平发生变化,表现为膀胱肿瘤细胞上皮标志物E-Cadherin、ZO-1的蛋白和mRNA表达随M2巨噬细胞数量变化呈正相关性,而膀胱肿瘤细胞间质标志物vimentin、N-Cadherind的蛋白及mRNA表达量则下降。(3)NF-κB通路激活,在一定数量的M2巨噬细胞作用下,随着M2巨噬细胞数量增加,NF-κB特异性蛋白:N-p65,N-p50的表达水平升高,膀胱肿瘤细胞胞质中的磷酸化p-IKKα/β升高,然而该信号通路的抑制蛋白IκB明显下降。通过W-B检测实验证实,当PDTC能够有效抑制NF-κB信号通路的活性时,经过M2巨噬细胞共培养诱导的膀胱肿瘤细胞EJ,T24细胞EMT被明显抑制。上皮标志物:ZO-1、E-Cadherin,间质标志物:N-cadherin、vimentin的表达水平均被有效抑制。(4)M1巨噬细胞通过抑制NF-κB通路活性,达到抑制经M2巨噬细胞共培养诱导的膀胱肿瘤的EMT作用的效果。通过蛋白及mRNA水平的实验检测,发现肿瘤ZO-1、E-Cadherin表达明显上调,间质蛋白N-cadherin、vimentin表达水平则明显下调。结论M2巨噬细胞可诱导人膀胱肿瘤细胞发生EMT,NF-κB信号通路正向调控M2巨噬细胞诱导的膀胱肿瘤细胞EJ,T24的EMT生物学进程。M1巨噬细胞可抑制M2诱导的膀胱上皮间质转化,且M1巨噬细胞可抑制NF-κB活性。我们的工作表明NF-κB在M2巨噬细胞引发膀胱肿瘤细胞EJ,T24的EMT的过程中发挥重要的生物学作用,肿瘤微环境中M1巨噬细胞可以抑制M2巨噬细胞的诱导的促癌作用。