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黑色素瘤缺乏因子AIM2是近年来新发现的一种DNA受体,是HIN200家族成员之一,最先作为一种黑色素瘤抑制基因而被发现。该基因含有不稳定的微卫星位点,在许多肿瘤疾病中该位点发生突变,导致AIM2基因失活、功能缺失。目前,关于AIM2功能的报道主要是作为细胞质DNA受体,能够与ASC和caspase-1形成炎性复合体,参与宿主对多种DNA病毒和胞内菌的天然免疫反应。有研究表明,沙门菌不能够活化骨髓来源巨噬细胞中的AIM2炎性体,AIM2在沙门菌感染中的作用尚不清楚。为了探索AIM2在沙门菌感染中的作用,更好的理解宿主对沙门菌的固有免疫反应,本课题利用AIM2基因缺失小鼠,通过沙门菌诱导的肠炎模型,分析AIM2在沙门菌感染中的作用,并阐明其分子调控机制,以期为沙门菌病的防治提供理论指导。首先,我们分别用沙门菌黏膜感染和沙门菌系统感染WT和AIM2基因缺失小鼠,分析AIM2在沙门菌感染中的作用。结果发现AIM2基因缺失小鼠对沙门菌黏膜感染更为易感,表现为更高的死亡率,肝脏和脾脏组织荷菌数显著增加;表明AIM2能够抗沙门菌感染。沙门菌进入肠道后,打破黏膜屏障,扩散全身引起系统感染。因此,两种基因型小鼠对沙门菌黏膜感染易感性的差异可能是由于肠道屏障功能存在缺陷引起的,也可能是由于机体对细菌的清除能力存在差异引起的。因此,我们进行了沙门菌的系统感染分析两种基因型小鼠对细菌的清除是否存在差异。结果发现在沙门菌系统感染中,WT和AIM2缺失小鼠对沙门菌具有相似的易感性,表明两种基因型小鼠对细菌的清除并不存在差异。以上结果提示我们可能肠道中的AIM2发挥了抗沙门菌感染的作用。因此,我们将AIM2的功能限定在肠道,并着重分析AIM2对沙门菌诱导肠炎的影响。为了进一步探索AIM2是否能够调控局部肠道免疫反应,随后进行沙门菌黏膜感染。结果发现,同野生型小鼠相比,AIM2基因缺失小鼠表现出更为明显的体重减轻;感染后第2天,脾脏重量增加明显,盲肠损伤更为严重;盲肠,肝脏,脾脏,肠系膜淋巴结组织荷菌数显著增加;盲肠组织炎性细胞因子释放显著增加;感染后第3天,4天,5天,AIM2基因缺失小鼠盲肠部位组织病理损伤更为严重。以上结果表明AIM2能够限制沙门菌诱导的肠炎,有利于肠道稳态的维持。肠道上皮细胞的更新对于肠道屏障的完整和肠道稳态的维持具有重要意义。因此,我们随后检测AIM2对肠道上皮细胞更新的影响。首先,通过免疫荧光的方法检测盲肠上皮细胞增殖情况。结果发现,同WT小鼠相比,在未感染沙门菌的情况下,AIM2基因缺失小鼠盲肠上皮细胞增殖数量增加;而在沙门菌感染2天后,AIM2基因缺失小鼠盲肠上皮细胞增殖数量减少。随后,通过TUNEL染色和western blot的方法,对肠上皮细胞凋亡情况进行检测。结果发现,同WT小鼠相比,AIM2基因缺失小鼠在感染沙门菌后,肠上皮细胞凋亡增加。由以上结果可知,AIM2有利于肠上皮细胞增殖和凋亡稳态的维持。尽管,我们不能排除沙门菌感染后AIM2基因缺失小鼠异常的肠上皮细胞更新可能是由于过度的肠道炎症引起的,但是在未感染沙门菌的情况下,AIM2基因缺失小鼠异常的肠上皮细胞增殖可能导致肠道屏障功能减弱,进而导致细菌的异常扩散。为了验证这种可能,我们检测感染早期,细菌穿过上皮屏障扩散到深层组织的情况。沙门菌黏膜感染WT和AIM2基因缺失小鼠3小时后,AIM2基因缺失小鼠肠系膜淋巴结,肠道黏膜固有层细菌数量显著增加。由此说明AIM2基因缺失后,肠道屏障功能减弱。为了进一步论证这一发现,我们在体外Caco-2细胞系上过表达了AIM2,并检测沙门菌穿过细胞单层的数量。结果发现,AIM2过表达后,细菌从细胞旁通路穿过单层上皮细胞的数量显著减少。由此说明AIM2能够促进单层细胞屏障功能,限制细菌经细胞旁通路扩散。紧密衔接是细胞旁通路中一种重要的屏障结构,封闭细胞与细胞之间的缝隙。因此,我们对细胞旁紧密衔接蛋白的表达情况进行检测。通过免疫荧光,western blot和实时荧光定量PCR方法检测紧密衔接蛋白在盲肠部位的表达情况。结果发现,在未感染沙门菌的情况下,AIM2缺失小鼠盲肠紧密衔接蛋白claudin3的表达降低,occludin的m RNA表达量降低,ZO-1的m RNA表达不受影响。随后进一步验证这一发现,我们对Caco-2细胞系和过表达AIM2的Caco-2细胞系中claudin3的表达进行检测。结果发现,AIM2过表达后,claudin3的表达增加,且单层细胞的跨膜电阻增加。而沙门菌感染后,claudin3的表达降低,但是AIM2过表达的Caco-2细胞中claudin3的表达水平高于Caco-2细胞。以上结果表明,AIM2能够促进紧密衔接蛋白的表达,促进肠道屏障功能的完整,从而限制沙门菌在肠道内的扩散。随后,我们进一步分析AIM2的这种调节作用是如何实现的。体外研究发现,AIM2过表达的Caco-2细胞中,Akt的磷酸化水平增加;在沙门菌感染30 min,60 min后,Akt的磷酸化水平逐渐降低,claudin3的表达也逐渐降低,沙门菌感染120 min后,Akt磷酸化水平升高,claudin3的表达水平也随之升高。随后采用Akt抑制剂处理细胞,结果发现Akt抑制剂能够抑制AIM2介导的claudin3表达水平的上调和细胞跨膜电阻的增加,抑制AIM2介导的限制细菌穿过单层细胞作用。但是AIM2介导的这些作用不受caspase-1抑制剂的影响。以上结果表明,AIM2能够通过Akt信号促进紧密衔接蛋白的表达。终上所述,AIM2缺失后,紧密衔接蛋白表达降低,肠道屏障功能减弱,更利于沙门菌扩散到深层组织,从而导致AIM2基因缺失小鼠对沙门菌诱导的肠炎更为易感。