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研究背景与研究目的阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)又称老年性痴呆,是发生于老年和老年前期、以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统病变,是一种慢性进行性中枢神经系统变性疾病,是老年期痴呆的最常见类型。临床上表现为渐进性记忆障碍、失语、失用、失认、视空间能力损害、抽象思维和计算力损害、人格和行为的改变等。阿尔茨海默病国际(Alzheimer’s Disease International, ADI)发布年度报告显示,2010年全世界约有痴呆患者3560万例,2030年将达到6570万例,2050年将达1.1540亿例,其中约50-75%为AD患者。2010年全球因痴呆带来的经济负担约为6040亿美元,约为全球GDP总量的1%。迄今为止,对于AD尚无特效治疗方法。究其原因,主要是我们对AD的病因和发病机制的尚不明了。因此,进一步深入研究AD的病因和发病机制,并在此基础上探索防治AD的新方法仍是目前亟需解决的重大问题。AD组织病理学上的两个经典的改变为神经炎性斑和神经原纤维缠结。淀粉样蛋白级联反应假说在AD的发病机制研究中一直占有核心地位,认为Aβ的沉积导致了脑内神经元的功能异常和死亡。p分泌酶又称p位点APP裂解酶1(β-site APP cleaving enzyme1, BACE1),是一种膜结合的天冬氨酸蛋白酶,是裂解APP产生A β的限速酶。非编码NRA (noncoding RNA, ncRNA)是指不能翻译为蛋白质,但具有生物学功能的RNA。长非编码RNA (long noncoding RNA, lncRNA)是指长度超过400个核苷酸的非编码RNA,包括长基因间非编码RNA (long intergenic noncoding RNA, lincRNA)、自然反义转录物(natural antisense transcript, NAT)和重复非编码RNA(non-coding RNA repeats)等。BACE1反义转录物(BACE1antisense transcript,BACE1-AS)是一种保守的长约2kb的lncRNA,由定位于11号染色体上的BACE1基因位点(11q23.3)对侧链转录生成。在AD患者额叶皮层、海马和内嗅皮层等部位均可见BACE1-AS含量的明显升高和BACE1mRNA含量的轻度升高,提示BACE1-AS可能参与了AD的发病机制。已有研究表明,BACE1-AS对BACE1mRNA的表达具有明显的调节作用,可以与BACE1mRNA结合,增加后者的稳定性,进而促进Aβ的生成；并且Aβ1-42在体外可以促进BACE1-AS表达的上调,实现Aβ生成的正反馈激活机制。那么,Aβ1-42在体内是否同样具有激活BACE1-AS,增加BACE1mRNA含量,并促进Aβ生成的作用?在APPsw转基因细胞内,BACE1-AS是否参与了BACE1表达和Aβ生成调节机制?A β1-42激活BACE1-AS表达上调的机制是什么呢?依据上述背景,本研究首先在体内观察了外源性Aβ1-42对C57/BL6J小鼠脑内BACE1-AS、BACE1表达和Aβ生成的影响；在体外采用AD细胞模型观察了APPsw基因转入对BACE1-AS、BACE1表达和Aβ生成的影响,以及siRNA干扰抑制BACE1-AS的表达对Aβ生成的影响；在体内、体外分别观察了NF-κB对A β1-42促进BACE1-AS表达上调和Aβ生成的介导作用机制。研究内容1. BACE1-AS介导外源性Aβ1-42对细胞和动物BACE1表达和Aβ生成的促进作用机制。2. BACE1-AS参与APPsw转基因细胞BACE1表达和Aβ生成的作用机制。3. NF-κB调节BACE1-AS表达和Aβ生成的作用机制。研究方法1.为了明确A β142在体内是否同样具有激活BACE1-AS,增加BACE1mRNA含量,并促进Aβ生成的作用,首先在部分重复外源性Aβ1-42在体外对BACE1-AS表达激活作用的基础上,采用BACE1-AS的siRNA干扰BACE1-AS的表达,观察其对BACE1mRNA和BACE1蛋白表达,以及对A β1-40生成的影响；然后采用立体定向技术将外源性A β1-42直接注入C57/BL6J小鼠脑内海马区,观察小鼠脑内BACE1-AS、BACE1mRNA的表达水平和A β1-40的含量。2.为了明确BACE1-AS是否参与了APPsw转基因细胞内BACE1表达和Aβ生成的作用机制,首先采用将APPsw基因稳定转染入HEK293细胞所得的细胞株20E2作为研究对象,观察APPsw基因转入对体外培养细胞的BACE1-AS、BACE1mRNA表达及Aβ1-40、Aβ1-42生成的影响；然后采用RNA干扰技术抑制BACE1-AS的表达,观察其对BACE1mRNA和BACE1蛋白表达的影响,以及对Aβ1-40和Aβ1-42含量的影响。3.为了明确NF-κB是否参与了对BACE1-AS表达的调控,首先检测了Aβ1-42立体定向注射入海马后NF-κB的表达情况,Aβ干预对体外培养的SH-SY5Y细胞NF-κB的表达情况,以及APPsw转基因细胞内NF-κB的表达情况；然后,在体外培养的SH-SY5Y细胞加入Aβ1-42处理之前给予NF-κB的抑制剂celastrol处理,采用NF-κB的抑制剂celastrol干预APPsw转基因细胞20E2,分别观察对BACE1-AS、BACE1mRNA表达,BACE1蛋白含量,以及对Aβ生成的影响。研究结果1. BACE1-AS介导外源性Aβ1-42对细胞和动物BACE1表达和Aβ生成的促进作用机制。1.1外源性Aβ1-42在体外促进了SH-SY5Y细胞BACE1-AS、BACE1的表达和Aβ的生成。1μM的Aβ1-42作用于体外培养的SH-SY5Y细胞后2hr可见BACE1-AS、 BACE1mRNA、以及BACE1蛋白的表达明显升高,干预后24hr细胞外液的A β1-40的含量明显升高。上述结果与Faghihi MA等的报道结果一致。BACE1-AS的siRNA预处理明显抑制了Aβ1-42对SH-SY5Y细胞BACE1-AS、BACE1的表达和Aβ生成的促进作用。加入siRNA预处理后,细胞内BACE1-AS、BACE1mRNA的含量均明显降低,细胞内BACE1蛋白表达明显减低,细胞外液Aβ1-40的浓度明显下降。这说明抑制BACE1-AS的表达可以抑制外源性A β1-42对细胞BACE1表达和Aβ生成的促进作用,从而打断Aβ通过激活BACE1-AS,增加BACE1mRNA稳定性,继而增加BACE1含量和Aβ生成的正反馈循环机制。1.2外源性Aβ1-42在体内促进了C57BL/6J小鼠脑内BACE1-AS、BACE1的表达和Aβ的生成。与对照组相比,外源性A β1-42干预3天后,注射侧海马BACE1-AS、 BACE1mRNA的表达明显升高,Aβ1-40的含量明显增高。上述结果说明,立体定向注射后,外源性Aβ1-42在体内同样可以促进小鼠脑内BACE1-AS、BACE1的表达和Aβ生成。2. BACE1-AS参与APPsw转基因细胞BACE1表达和Aβ生成的作用机制。2.1APPsw基因转入对细胞内BACEl-AS、BACE1表达及Aβ1-40、Aβ1-42生成的影响。稳定转入APPsw所得的20E2细胞内BACEl-AS、BACE1mRNA的表达明显升高,细胞外液中Aβ1-40和Aβ1-42的含量也明显高于HEK293细胞。这说明在APPsw转基因细胞内,同样存在BACE1-AS表达的异常激活。2.2siRNA抑制APPsw转基因细胞20E2内BACE1-AS表达对BACE1mRNA和BACE1蛋白表达及Aβ1-40、Aβ1-42生成的影响。采用siRNA干扰BACE1-AS的表达后,20E2细胞内BACE1mRNA和BACE1蛋白的含量均明显降低,细胞外液中A β1-40和A β1-42的含量也明显低于未处理组。这说明抑制BACE1-AS的表达,可以抑制内源性A β1-42通过促进BACE1-AS异常表达所产生的正反馈循环,从而明显减少Aβ的生成。3. NF-κB调节BACE1-AS表达和Aβ生成的作用机制。3.1NF-κB介导了外源性Aβ1-42对BACE1-AS表达的激活作用。在C57BL6J小鼠脑内海马区立体定向注射入Aβ1-42后第3天,可以观察到phospho-NF-κB p65含量的明显增加。体外培养的SH-SY5Y细胞在1μM的A β1-42处理2hr后,phospho-NF-κBp65的含量明显增加,而加用5μM的celastrol预处理则可使phospho-NF-κB p65的含量明显减低。说明Aβ1-42在体内外均可以促进NF-κB的活化,celastrol可以抑制Aβ1-42诱导的NF-κB活化。采用celastrol抑制Aβ1-42诱导的NF-κB活化后,BACE1-AS、BACE1mRNA的含量均明显减少,细胞内BACE1蛋白的含量和细胞外液Aβ1-40的含量也明显降低；而采用BACE1-AS siRNA干扰虽然可以抑制BACE1-AS表达的增强和A β1-40生成的增加,但不能抑制phospho-NF-κB p65含量的增加。由此,我们可以明确,NF-κB介导了外源性Aβ1-42对BACE1-AS表达和Aβ生成的促进作用。3.2NF-κB介导了APPsw转基因细胞20E2内BACE1-AS表达的激活作用。20E2细胞内phospho-NF-κB p65的含量明显高于HEK293细胞。这说明APPsw基因转入在体内外均可以引起NF-κB的异常激活。在20E2细胞培养基中加入5μM的celastrol抑制NF-κB的活性后,细胞内BACE1-AS、BACE1mRNA的表达明显降低,BACE1蛋白的含量明显降低,细胞外液中Aβ1-40和Aβ1-42的含量也明显低于对照组。而采用BACE1-AS siRNA干扰虽然可以抑制BACE1-AS表达的增强和Aβ1-40、Aβ1-42生成的增加,但不能抑制phospho-NF-κB p65含量的增加。这说明,NF-κB同样介导了内源性Aβ1-42对BACE1-AS表达以及Aβ生成的促进作用。结论1. BACE1-AS介导了外源性Aβ1-42对细胞和动物BACE1表达和Aβ生成的促进作用机制。2. BACE1-AS参与了APPsw转基因细胞BACE1表达和Aβ生成的作用机制。3. NF-κB介导了Aβ1-42促进BACE1-AS表达以及Aβ生成的作用机制。