标记免疫分析技术具有灵敏度高、特异性强等优点,已被广泛应用于基础医学和临床各个领域。近年来,由于新原理、新技术的不断应用,标记免疫技术得到了长足的发展。最常用的标记免疫分析技术是放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)和酶免疫分析(Enzymatic immunoassay,EIA),但RIA和EIA在应用中也存在着一些缺陷:RIA的放射性核素污染、标记物的货价期短;EIA酶的活性容易失活,导致EIA的灵敏度不高,酶的大分子标记容易影响被标记物的空间结构,使得EIA灵敏度的提高受到限制。而用普通荧光分子作为标记物容易受到散射光、样品的背景荧光和荧光淬灭等诸多因素的干扰,导致分析的灵敏度低,很难适应微量抗原抗体检测的需要。20世纪80年代初发展起来的时间分辨荧光免疫分析(Time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)技术,克服了放射免疫分析的同位素污染、半衰期短及酶免疫分析方法稳定性差等缺点,具有快速、灵敏、稳定等特点,并广泛应用于生物医学研究和临床医学检验。丙型肝炎病毒抗体(anti-HCV)是机体感染丙肝病毒后产生的针对丙肝病毒的抗体,不具有保护性,目前在医院和血液系统广泛使用的检测方法为酶免疫分析法,但酶免法灵敏度较低,易造成漏检;乙型肝炎病毒核心抗体IgM(抗HBc-IgM)是机体对HBV的感染产生的免疫应答,IgM抗体阳性常表示病毒的近期感染,是HBV感染者血清中最早出现的特异性抗体,是HBV复制具有传染性的标志,目前相关的检测方法有微粒子酶免疫分析(MEIA)法、酶联免疫法和固相放射免疫法(SPRIA),酶免法较其他两种方法更具临床可操作性,且不会有放射性同位素的污染,但是酶免法本身也存在灵敏度不够高、酶标记物不稳定的缺点;乙型肝炎病毒前S1抗原(HBV-preS1Ag)是乙肝病毒基因组S基因区中preS1基因编码的产物,在急性乙型肝炎中,疾病早期转氨酶升高前即可检测出前S1抗原,也可作为乙肝病毒感染的早期诊断指标。若preS1先于HBV-DNA阴转是病毒清除的最早迹象,提示疾病的预后良好,反之preS1抗原持续阳性,将发展至慢性肝炎。检测抗HBc-IgM和HBV-preS1Ag是对诊断急性乙型肝炎的补充和加强,因此他们已成为临床上除了乙肝五项之外的常规检查项目。本研究主要是运用时间分辨荧光免疫分析技术依次采用间接法、捕获法和双抗体夹心法研制丙型肝炎病毒抗体、乙肝病毒核心抗体IgM和乙肝病毒前S1抗原的诊断试剂,评价试剂的各项性能指标包括:准确性及灵敏度、cutoff值的确定、特异性、精密度、稳定性,并与国内同类的ELISA诊断试剂进行比较,评价其应用于临床检测的可行性。研究结果显示(1)抗-HCV-TRFIA试剂盒的准确性及灵敏度均符合抗HCV试剂国家标准品所规定的要求;cutoff值为阴性对照荧光值×2.1;与抗HBs、抗HBe、抗HBc、梅毒螺旋体抗体、HIV(1+2)抗体国家标准品中的精密度参考品无交叉反应,特异性较好;试剂盒分析内变异系数为3.2%-9.3%,分析间变异系数为4.6%-8.9%;试剂放置于37℃7天或者4℃一年,检测荧光值无明显下降且分析内CV<10%,分析间CV<15%,稳定性较好;检测样本不受甘油三酯、胆红素、血红蛋白的干扰;测定508份临床血清标本与国内同类试剂比较,自制试剂优于酶免试剂且灵敏度更高。(2)抗HBc-IgM TRFIA试剂盒的cutoff值为阴性对照荧光值×2.5;与抗-HBs,抗-HBc-IgG,抗-HBe抗体无交叉反应;分析内及分析间变异系数均小于10%;试剂可在4℃稳定一年,37℃稳定7天,分析内及分析间CV仍低于10%;检测样本不受甘油三酯、胆红素、血红蛋白的干扰;测定584份临床血清标本与国内同类试剂比较,自制试剂优于酶免试剂且特异性更高。(3)HBV-preS1Ag TRFIA试剂盒的cutoff值为阴性对照荧光值×2.5;与用正常人血清稀释的HBsAg和HBeAg无交叉反应;试剂盒分析内变异系数为3.2%～8.3%,分析间变异系数为5.1%～10.9%;试剂放置于37℃7天或者4℃一年,分析内CV<10%,分析间CV<15%,稳定性较好;检测样本不受甘油三酯、胆红素、血红蛋白的干扰;测定280份临床血清标本与国内同类试剂比较,自制试剂优于酶免试剂且灵敏度更高。可见本文研制的HBV、HCV TRFIA试剂盒的各项指标(灵敏度、精密度、特异性、稳定性、准确性)均达到临床检测要求,具有临床测定的前景。