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目的:本课题采用不同浓度的As2O3联合TPA作用于体外培养人白血病细胞系HL-60的方法,从形态学、免疫学以及分子生物学方面,分析不同浓度的As2O3以及联合TPA对HL-60细胞的诱导分化及凋亡作用特点,并探讨其诱导分化及凋亡的机制。
对象与方法:1.HL-60细胞(目前认为是M2型白血病细胞株)培养于含15%灭活胎牛血清的RPMI-1640培养液中,置于CO2培养箱内(CO2浓度为5%,相对湿度为95%,温度为37℃)。
2.在细胞对数生长期取适量,离心,去除上清,用RPMI-1640培养液调制成密度为5~10×105个/ml。随机分为八组,每组9ml。分别为:①对照组:(自身对照,条件同TPA组,只是不加TPA);②TPA组:加入TPA(终浓度为1.6×10-8mol/L);③As2O3组:细胞培养24小时后加入As2O3(终浓度分别为0.2×10-6mol/L、2.0×10-6mol/L、20×10-6mol/L);④TPA+As2O3组:加入TPA(终浓度为1.6×10-8mol/L)诱导24小时后加入不同浓度的As2O3(As2O3的终浓度为分别为0.2×10-6mol/L、2.0×10-6mol/L、20×10-6mol/L),常规培养。
3.观察指标:①细胞形态学改变:于培养24小时,48小时,72小时,在倒置显微镜下观察活细胞的生长状况;②活细胞台盼兰计数;③MTT比色法测定细胞增殖情况:培养72小时后每孔加入5g/LMTT20μl,用酶标仪(λ490nm)测定每孔OD值;④流式细胞免疫分析:培养72小时细胞后,流式细胞仪测定各组细胞表面抗原CD33、CD64的表达情况;⑤DNAladder电泳:收集培养72小时的各组细胞,提取DNA,经过琼脂糖凝胶电泳,显象;⑥用TUNEL法检测细胞凋亡数。