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棉蚜Aphis gossypii (Glover),一种世界性分布的半翅目蚜科蚜属的多食性昆虫,发生数量大,繁殖速度快,是棉花苗期的重要害虫之一,在中国各棉区均有发生。吡虫啉,作为第一个商品化的新烟碱类杀虫剂,对包括棉蚜在内的大多数刺吸式口器害虫有良好的防治效果,但由于长期的不科学用药,害虫对吡虫啉的抗性问题越来越严重。已有研究表明,昆虫对吡虫啉的抗性机制主要是靶标抗性和代谢抗性,而靶标抗性是昆虫抗药性的重要机制,尤其与高水平抗性有关。无论是靶标抗性还是代谢抗性,均是由于基因差异造成的。靶标不敏感性是昆虫抗药性的重要机制,尤其与高水平抗性有关。本文主要研究靶标抗性方面的内容。已有研究发现,位于nAChRs亚基上Loop D区域的81位氨基酸高度保守(大鼠中为77位),能与吡虫啉的硝基直接作用,并影响与吡虫啉的结合。我们在室内筛选的高抗吡虫啉品系棉蚜nAChRs的β1亚基发现了81位氨基酸从精氨酸到苏氨酸的点突变,该突变在田间抗吡虫啉桃蚜和棉蚜体内亦被证实,但该突变导致昆虫对吡虫啉产生抗性的分子机制尚不明确。本文利用荧光定量PCR的方法研究了抗性和敏感品系棉蚜体内的nAChRs各亚基的表达量差异；通过免疫共沉淀和免疫印迹分析筛选出了棉蚜体内nAChRs亚基组合情况,然后通过爪蟾卵母细胞表达技术体系,体外重组构建和表达棉蚜的重组杂合nAChRs,进一步应用电压钳技术比较了含有点突变和不含点突变的的重组nAChRs对乙酰胆碱和吡虫啉的结合差异；同源建模构建棉蚜AChRs亚基的3D模型,通过分子对接分析比较了野生型和突变型棉蚜AChRs与吡虫啉的结合能力。具体研究结果如下：利用荧光定量PCR研究了抗性和敏感品系棉蚜nAChRs各亚基的表达量。结果表明,与敏感品系棉蚜相比,抗性品系体内AChRs各亚基的mRNA表达量下降,但表达下降的程度较低。推测在抗性品系棉蚜体内,nAChRs亚基基因的低水平表达可能造成了靶标兴奋性突触后电位的量降低,间接导致棉蚜对吡虫啉产生抗性。分别以棉蚜AChRs亚基的胞内大环区域Aga1 (R348-G441)、Aga2 (P359--C445)、 Aga3 (I350-S451)、 Aga4-1 (I344-R480)和Agβ1 (K349-E441)为模板合成融合蛋白作为抗原制备多克隆抗体。棉蚜头部膜蛋白用去垢剂提取后,分别用Agβ1的抗体和各a亚基的抗体进行免疫共沉淀试验,免疫共沉淀的产物通过免疫印迹分析,发现Agα3和Agp1在棉蚜体内是互相结合的,因此,Agα3和Agβl能够在棉蚜体内组成具有功能活性的异源五聚体型nAChRs。分别将棉蚜AChRs亚基Agα3 (Genbank登录号EF626657.1)和大鼠(Rattus norvegicus) β2亚基Rβ2T77 (Genbank登录号L31622)构建到pT7TS表达载体中,利用定点突变技术将大鼠β2亚基77位苏氨酸对应的碱基序列进行突变,得到了翻译后77位氨基酸为精氨酸的Rβ2R77。质粒经内切酶线性化后,体外转录得到Agα3、Rβ2R77和R1β2T77的cRNA,将大鼠的两种β2亚基Rβ2R77和Rβ2T77cRNA分别和棉蚜nAChRs α3亚基cRNA按1：1的比例注射到第V期的爪蟾卵母细胞内进行异源表达,分别得到了棉蚜重组杂合nAChRs, Agα3Rβ2R77(野生型)和Agα3Rβ2T77(突变型)。然后采用电压钳分别测定野生型和突变型的棉蚜重组杂合nAChRs对吡虫啉和乙酰胆碱的剂量反应。结果表明：对于乙酰胆碱,表达有突变型Agα3/Rβ2T77的卵母细胞和野生型Agα1/Rβ2R77的卵母细胞的最大内向电流(Imax)和ECso没有明显差异(p<0.01)；对于吡虫啉,表达有突变型Agα1/Rβ2T77的卵母细胞对吡虫啉的的EC50要明显高于野生型Agα1/Rβ2R77的卵母细胞,但突变型的最大内向电流要小于野生型(p<0.01)。说明棉蚜]AChRs β亚基81位氨基酸残基由精氨酸突变为苏氨酸后,能引起nAChRs结合吡虫啉的能力下降,导致棉蚜对吡虫啉产生抗性。采用SWISS-MODE1在线服务器,选择石纹电鳐(Torpedo marmorata) nAChRs蛋白(PDB号：2BG9)的D链和C链分别作为棉蚜α3和β1两个亚基分子的模板进行同源建模,利用Autodock 4.0软件分别将毗虫啉与Agα3/Agβ1R81和Agα3/β1T81进行分子对接。结果表明：Agα3/Agβ1R81(棉蚜p1亚基81位氨基酸为精氨酸R)与吡虫啉结合时能形成两个氢键,距离分别为1.9 A和2.1A；而Agα3/Agβ1T81(棉蚜p1亚基81位氨基酸为苏氨酸T)与吡虫啉结合时只能形成一个氢键,距离长为3.3A。说明当81位氨基酸为没有突变的精氨酸时,nAChRs与吡虫啉的结合更加紧密,更加牢固。这也为棉蚜AChRs β1亚基81位氨基酸残基由精氨酸突变为苏氨酸后导致棉蚜对吡虫啉的抗性增高提供了证据。