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大量实验结果显示:细胞内的活性氧调节细胞死亡的发生,包括细胞凋亡和坏死两种方式。细胞凋亡事件中两条主要的途径是线粒体途径和死亡受体途径,caspases是细胞凋亡的主要执行者,而作为线粒体途径的上游caspase分子-caspalse-9的激活和活性氧有着密切的关系。Caspase-9分子含有13个半胱氨酸,并且其活性依赖其活性中心的半胱氨酸,因此caspase-9成为氧化修饰调节的可能靶点,但是相关的研究报道并不多见。
本研究旨在揭示活性氧介导caspase-9激活的分子机制。文中采用了三个实验模型开展研究:(1)在HeLa细胞整体水平用H2O2诱导细胞氧化应激;(2)Diamide在去线粒体胞浆系统中氧化caspase-9蛋白的巯基;(3)Diamide在凋亡复合体重组系统中氧化caspase-9蛋白的巯基。结果显示:细胞内的氧化状态能够易化caspase-9分子的激活;在细胞水平单独使用H2O2处理能使caspase-9分子发生剪切和激活,同时使caspase-9分子的巯基发生了氧化;用Co-IP和氧化/还原对角线二维电泳两种方法证明H2O2促进了二硫键介导的caspase-9分子和Apaf-1分子的相互作用;直接使用巯基氧化剂diamide也能促进二硫键介导的caspase-9分子和Apaf-1分子的相互作用。在去线粒体胞浆系统中,diamide使caspase-9分子的巯基发生氧化,并且不依赖细胞色素c浓度的增加促进caspase-9的剪切;氧化/还原对角线二维电泳结果提示diamide促进了二硫键介导的caspase-9和Apaf-1的相互作用。最后,使用了更纯化的体外凋亡复合体重组系统证实caspase-9分子的氧化修饰对其剪切有促进作用,并且一定程度的氧化修饰是caspase-9分子激活的必需条件。
研究首次证明:一定水平的活性氧对caspase-9蛋白分子直接的氧化修饰能介导caspase-9蛋白和Apaf-1蛋白的相互作用,进而促进caspase-9的剪切和激活,最终导致凋亡发生。Caspasc-9分子中巯基的一定程度的氧化修饰不但能促进caspase-9分子的激活,甚至是caspase-9分子激活所必需的。我们推测这可能是活性氧促进细胞凋亡的机制之一。通过氨基酸突变实验,初步排除了第12位和76位半胱氨酸参与了氧化修饰介导caspase-9剪切激活的可能性。氧化修饰介导caspase-9激活的半胱氨酸氧化位点有待进一步研究明确。