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研究背景目的：糖尿病肾脏疾病是糖尿病重要的微血管并发症之一,是终末期肾病最主要的病因。高血糖状态下肾小管结构功能的损伤早于肾小球是DKD主要的病理基础。免疫损伤参与糖尿病肾脏疾病的发生及发展是目前尚存争议的理论。TLR-NFκB激活途径是机体固有免疫的第一道屏障,参与机体天然防御反应。但过度激活会造成机体炎性反应,促进组织纤维化进程。目前关于TLRs固有免疫激活途径是否参与糖尿病肾脏肾小管间质纤维化进程的研究很少,有待于探讨。1,25(OH)2D3是一种具有免疫调节作用的激素。在固有免疫反应中,研究表明1,25(OH)2D3可能对TLRs具有双向调节作用。同时1,25(OH)2D3具有肾脏保护作用已经得到公认。研究的交叉点集中在对NF-KB的下调作用。1,25(OH)2D3是否通过对TLRs激活途径的抑制作用起到下调NF-KB的表达,有关这方面的研究内容目前国内外未见报道。因此,本课题的研究目的包括：(1)明确TLR是否通过MyD88依赖途径激活NF-κB,参与糖尿病大鼠肾小管间质纤维化的发生发展,证实DKD是固有免疫参与的免疫性肾病；(2)1,25(OH)2D3能否通过对TLR过度激活的固有免疫下调作用达到肾脏保护作用；(3)1,25(OH)2D3肾脏免疫治疗的剂量及安全性评估。依据上述实验结果,我们可以为DKD免疫损伤机制做一理论铺垫,并为1,25(OH)2D3的免疫调节机制奠定一定的理论基础,以便可以在临床上得以推广。研究方法：(1)动物实验：STZ诱导的雄性SD大鼠作为糖尿病动物模型。将观察大鼠随机分为7组：正常对照组(C组)、糖尿病未干预组(D组)、小剂量1,25(OH)2D3干预组(L组,0.025ug/kg/d)、中剂量1,25(OH)2D3干预组(M组,0.15ug/kg/d)、大剂量1,25(OH)2D3干预组(H组,0.3ug/kg/d)、氯沙坦钾干预组(A组,10.4mg/kg/d)及精蛋白锌胰岛素干预组(Y组,16U/kg/d)。糖尿病成模后每日1,25(OH)2D3及氯沙坦钾灌胃给药,胰岛素治疗组于颈后皮下注射给药。16周后留取24小时尿及随机尿样进行尿mALB及尿NAG检测；股动脉取血测定生化指标；左侧肾脏固定包埋,进行HE,Masson染色观察肾小管间质纤维化程度并进行间质损伤评分；免疫组织化学方法检测MCP-1)、α-SMA、NF-κB的肾小管间质表达情况。右侧肾脏称重冻存进行RT-PCR)、Western blot检测MCP-1)、α-SMA)、NF-κB)、TLR4)、MyD88的mRNA)、蛋白表达,并行冰冻切片免疫荧光检测观察TLR4)、MvD88的肾脏表达。(2)细胞实验：体外培养正常大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)。三个葡萄浓度进行干预培养(5.5mmol/L葡萄糖、25mmol/L葡萄糖、50mmol/L葡萄糖)分别于0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、24小时点收集细胞观察TLR4及MyD88的mRNA及蛋白表达。确定表达量达峰的葡萄糖浓度及时间点进行1,25(OH)2D3的干预实验。分组5.5mmol/L葡萄糖培养(LG组)、25mmol/L葡萄糖培养(HG组)、25mmol/L葡萄糖培养+1×10-9mmol/L1,25(OH)2D3(HG+10-9)、25mmol/L葡萄糖培养+1×10mol/L1,25(PH)2D3(HG+108)、25mol/L葡萄糖培养+1×10-7mol/L1,25(OH)2D3;(HG+10-7)、25mmol/L葡萄糖培养+1×10-5mol/L氯沙坦钾(HG+ARB)。于6小时收集细胞进行TLR4及MyD88的mRNA检测,24小时收集细胞行Western blot及细胞免疫荧光检测观察TLR4及MyD88的蛋白表达。研究结果：1、动物实验结果：(1)STZ诱导的糖尿病大鼠成型16周后,未干预组糖尿病大鼠血糖、尿mALB、尿NAG、尿素氮(BUN)、肌苷(Cr)、肾体比、间质损伤评分、肾脏MCP-1及α-SMA的表达较正常对照组均明显升高；大剂量1,25(OH)2D3及胰岛素、ARB治疗组能显著降低尿mALB、尿NAG、尿素氮(BUN)、肌苷(Cr)水平,间质损伤评分,降低MCP-1及α-SMA的表达,从而起到肾脏保护作用。中小剂量1,25(OH)2D3作用不显著。(2)未干预组糖尿病大鼠肾脏TLR4、MyD88及NF-κB的mRNA及蛋白表达较正常对照组均明显升高,大剂量1,25(OH)2D3及胰岛素、ARB治疗组能显著降低TLR4.MvD88及NF-κB的表达。TLR4、MvD88及NF-κB与尿mALB、BUN、SCr、间质损伤评分、肾脏MCP-1及α-SMA的表达存在正相关。(3)各组大鼠血钙磷、肝功能比较没有显著性差异,1,25(OH)2D3各干预组的尿钙排出较正常对照组显著增高。2、细胞实验结果：(1)NRK-52E细胞TLR4、MyD88的mRNA表达在25mmol/L葡萄糖培养6小时达到高峰,蛋白表达在25mmol/L葡萄糖培养24小时达到高峰,与其他葡萄糖浓度及时间点比较均存在显著性差异。(2)1×10-7mol/L的1,25(OH)2D3能够显著降低TLR4、MyD88的mRNA及蛋白表达,而1×10-8mol/L,1×10-9mol/L作用不明显。结论：1、肾小管间质病变是糖尿病肾脏疾病发生发展过程中的重要组成部分,TLR4-NF-κB介导的固有免疫反应过度激活造成的肾小管间质炎性反应参与了糖尿病肾脏疾病的发生发展。2、1,25(OH)2D3能够抑制STZ诱导糖尿病大鼠肾脏TLR4、MyD88及NF-κB的表达,从而抑制NF-κB对MCP-1及a-SMA的上调作用减轻间质免疫炎症反应,阻抑EMT的发生,减少尿蛋白的漏出,延缓肾小管间质纤维化的进程。3、体外实验得到相同结果,25mmol/L高糖培养的肾小管上皮细胞TLR4及MyD88表达增高,1×10-7mol/L浓度的1,25(OH)2D3能够抑制高糖培养的肾小管上皮细胞TLR4及MyD88的表达,抑制固有免疫的过度激活。4、本实验中,1,25(OH)2D3对STZ诱导的糖尿病大鼠肾病的干预剂量相对安全,但1,25(OH)2D3所引发的高尿钙状态仍需要长期观察和探讨。