1研究背景及目的泌尿系结石(Urolithiasis)是泌尿系统的常见疾病,迄今为止,对尿石形成的预防尚无十分理想的方法,80%以上的患者病因不清。在外科治疗方面结石病的治疗主要有经皮肾造瘘,输尿管镜取石等多种微创外科技术与体外碎石(ESWL)治疗,泌尿系结石治疗后复发率为30%-50%。如果能够从结石形成的机制出发,研制出对延缓结石形成的针对性药物,有极其重要的临床价值。结石的形成亦受到流体动力学等因素的影响,用计算机模拟有限元分析的方法来进行研究成为目前的热点,这就涉及到计算机建模的问题。如能利用相对较少的解剖数据,对泌尿系进行参数化构建,不仅可满足泌尿外科实验研究的需求,同时也能为泌尿外科动物实验及虚拟手术提供一个良好的平台。根据研究目的我们的研究分为四个部分：①对非洲绿猴肾小管上皮细胞采用体外培养的方法,采用H202对其进行损伤,观察损伤前后细胞成活率,并按损伤时间顺序测定细胞与氧化损伤有关的酶及大分子的表达,细胞微结构的变化以及对草酸钙晶体成核和聚集的影响。②对人近曲肾小管上皮细胞采用体外培养的方法,采用H202对其进行损伤,观察损伤前后细胞成活率,并按损伤浓度测定细胞与氧化损伤有关的酶及大分子的表达,细胞微结构的变化以及对草酸钙晶体成核和聚集的影响。③对日产大豆多糖进行提纯,并在体外尿液体系中进行相应检测,在非洲绿猴肾小管上皮细胞损伤模型的基础上,研究提纯前后的大豆多糖对Vero细胞中草酸钙晶体生长的调控作用。④使用Autodesk3ds Max8SP2软件,对COM及COD晶形及结石进行模拟；根据大鼠实体解剖,综合运用放样、布尔运算、多边形造模、倒角剖面和车削等手段,对肾、肾上腺、血管、膀胱、气管、甲状腺和血管等器官进行真实比例构建,合并到手术场景中,经渲染后获取各角度的三维图像。目前对实验用肾细胞的分类一般是根据动物来源进行划分的。最早培养的细胞来自于鼠,包括NRK-52E,髓质集合管细胞(pIMCD),大鼠的近端小管细胞(pMPT)等；第二种细胞来源于狗,如Madin-Darby犬齿肾细胞(MDCK);第三种来源于猴,如非州绿猴肾上皮细胞(BSC-1);第四种来源为猪,比如LLC-PK1;第五个来源为人,比如人的肾上皮细胞(HK-2)。在这里我们选取非洲绿猴肾小管上皮细胞(Vero)及人近曲肾小管上皮细胞(HKC)两种细胞株进行了研究。大豆多糖(SPS)是从大豆分离蛋白、豆腐和腐竹等生产加工的副产物豆渣纤维中提取,经过预处理、酶解(纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶等)、分离、脱色、灭菌、干燥等工艺精制而成,且具有来源广,价格低廉和无副作用等优点。分析表明,SPS主要成分是半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸,并含有鼠李糖、岩藻木糖及葡萄糖等多种成分。其结构是以鼠李半乳糖醛酸和高聚半乳糖酸为主链,半乳聚糖和阿拉伯糖为侧链结合的近似于球状结构体,具有良好的分散性、水溶性和乳化性等特点。在这里我们的研究采用过氧化氢(Sevag)法来降解日产大豆多糖。3D Studio Max软件是Kinetix(Autodesk公司的多媒体商业机构)推出的一个动画产品。使用它可以在PC机上得到真正的工作站动画软件的性能和图像质量。其经过不断的换代已成为目前世界上应用最广泛的三维建模,动画,渲染的大众化软件。在这里我们使用的是软件Autodesk3ds Max8SP2(美国,Autodesk公司,ID：666-12345678),操作平台为windows XP系统。2研究方法2.1VERO细胞损伤模型建立非洲绿猴肾小管上皮细胞株VERO购自中科院上海细胞库(编号：GN017),用含有10%新生小牛血清的DMEM-F12培养液培养,保持37℃及饱和湿度环境,每隔1天更换1次培养液。根据实验设计加入含有不同浓度H202的无血清培养液,细胞消化采用胰蛋白酶消化法,当细胞达80%-90%融合后,用PBS液洗涤细胞2次,用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化细胞,3-5min后于倒置显微镜下观察消化程度；当大部分细胞变圆,细胞分离散开,表明消化适度,加入含10%新生小牛血清的DMEM-F12培养液终止消化,充分吹打细胞使其形成单细胞悬液。用CCK-8法来检测H202造成细胞损伤的程度,用酶标仪在450nm处测量吸光度(A),计算细胞存活率(%),并绘制存活率-时间曲线和存活率-浓度曲线,细胞存活率(%)=A(实验组)/A(对照组)×100%2.2人肾小管上皮细胞损伤模型建立人肾小管上皮细胞由上海长征医院梅长林教授馈赠。细胞培养的条件同前,细胞采用不同浓度H202进行损伤,细胞种植培养液中含双氧水0.1,0.3,0.5,1.0以及2.0mmol/L H2O2的培养基中1h。对照组培养液不含H202。在指定的时间点,吸出培养液,细胞用PBS洗两次,并加入新鲜的培养基。然后,每孔加入10μ1的CCK-8。孵育4h后,450nm酶标仪检测。2.3细胞MDA和SOD浓度采用双抗体夹心法测定细胞中MDA、SOD浓度,包被单抗的微孔中依次加入丙二醛(MDA)／超氧化物歧化酶(SOD),再与HRP标记的MDA/SOD抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化作用下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色深浅和样品中的丙二醛(MDA)／超氧化物歧化酶(SOD)正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中丙二醛(MDA)／超氧化物歧化酶(SOD)的浓度。2.4细胞的OPN表达细胞加入4%多聚甲醛固定10min,再用PBS洗三次,每次3min；加入羊血清封闭20min,滴加入骨桥蛋白一抗(1：100),4℃过夜。PBS洗三次,避光滴加FITC二抗(1：100),37℃孵育30min后,PBS洗三次,最后用DAPI给细胞染色并封片,激光共聚焦显微镜观察荧光。细胞核为蓝色,骨桥蛋白显绿色。2.5SEM, XRD分析细胞结晶孵育后,取出盖玻片,用PBS液洗涤细胞2次,加入2.5%戊二醛固定24h,1%OsO4将细胞后固定,再用PBS液洗涤3次,梯度乙醇(30%、50%、70%、90%、100%)脱水,再用乙酸异戊酯固定后CO2临界点干燥,喷金包被。用SEM观察细胞形态和晶体生长情况,同时对盖玻片上的晶体进行XRD检测(5°<20<60°),确定晶体组分。2.6细胞Zeta电位检测细胞清洗后,用PBS洗去未粘附的晶体,加入0.25%胰酶-0.02%EDTA消化液,充分吹打细胞,使细胞和晶体脱落,以1,000rpm/s离心收集细胞和晶体,吸除上清液,加入1000μl pH=7.86的PBS缓冲液使细胞和晶体重新悬浮,于样品池中吸取约8001μ1悬浮液,用纳米粒度仪测其Zeta电位。2.7共培养后测量CaOxa的浓度细胞于6孔板中培养加入含有亚稳定的CaOxa溶液间质孵育6h。取出6孔板中的载玻片,然后用PBS洗涤以去除没有结合的晶体。载玻片放于25m1烧杯中。然后,倒入10mlHNO3和0.5ml HClO4,样品在电炉中消化直到清晰的固化形成。样品不断地加热直到HClO4沸腾,冒烟,直至干掉。加热干燥后置于室温冷却。然后,烧杯中加入3.0m1水溶解残留。溶液中Ca2＋浓度用ICP方法测量。CaOxa晶体的数量使用Ca2+浓度来测量,结果用微克／每平方厘米表示。2.8大豆多糖的提取采用Sevag法对SPS进行处理以除去SPS中可能存在的少量蛋白。向多糖溶液中加入0.2倍体积的Sevag试剂(V氯仿：V正丁e=5：1),将混合液剧烈振荡15分钟后离心(4000rpm,10min),此时溶液分为两层,上层为多糖溶液,下层为Sevag试剂与变性蛋白生成的凝胶。取上层液,再加入0.2倍体积的Sevag试剂,重复上述操作,共5次,合并水相,从中提取多糖。利用过氧化氢(H202)对SPS进行降解。称取1.2g多糖,用60m1蒸馏水溶解于100ml烧杯中,70℃条件下水浴搅拌溶解。溶解完毕后,迅速加入15m1体积分数为30%的H202,降解1.5h后,待溶液冷却,用浓度为2mol/L的NaOH溶液调pH值到7。然后将溶液转入圆底烧瓶中,在70℃水浴条件下旋转蒸发,待溶液体积减少至原体积的1／3时停止蒸发,加入60ml的无水乙醇沉淀多糖过夜,将沉淀过滤,干燥之后进行称重。2.9多糖理化性质测定采用苯酚-硫酸法测定了SPS中多糖的百分含量；采用粘度法测定降解前后SPS的平均相对分子质量。2.10泌尿系结石数字构建COM与COD单晶模型COM按六方体建模,先按比例建成圆柱形,边数设为6,双底面各顶点采用多边形编辑命令调整顶点位置。COD按四角双锥建模,先半高构建四棱锥,再用镜相命令于Z轴复制另一半,两个四棱锥成组。选用透明玻璃材质球,调整参数为颜色白色,透明度40,半透明80,折射率1.5,亮度200,赋予晶体材质。结石模型使用圆球体,保持表面光滑。先用FFD4×4×4圆柱体调整表面,再利用噪波分别于X、Y、z轴设置0-100的数值,材料球填加合适贴图。尿路采用管状体造模,FFD4×4×4圆柱体调整表面,移至与结石相适应的部位。分别渲染生成图片。2.11大鼠泌尿系数字构建使用Autodesk3ds Max8SP2软件运用放样、布尔运算、多边形造模、倒角剖面和车削等手段,对肾、肾上腺、血管、膀胱、气管、甲状腺和血管等器官进行真实比例构建,合并到腹部及颈部手术场景中,并安装自由摄像头经渲染后获取各角度的三维图像。2.12统计学分析统计学分析使用SPSS13.0软件。数据表达采用均数±标准差来表示(χ-±s)。细胞存活率检测采用One-Way ANOVA或Two-Way ANOVA方法,MDA、SOD, OPN表达,结晶体大小,数目等采用One-Way ANOVA方法检验,先进行Levene检验方差齐性,若P0.05,选择基于方差齐性的方差分析结果；若P<0.05选择基于方差不齐的方差分析结果(Welch法)。若方差分析显著后,则进一步多重比较,方差齐者采用LSD法比较,方差不齐者采用Games-howell比较法。降解前、后SPS的含糖量检测采用配对样本t检验。P<0.05认为是差异具有统计学意义。3结果1浓度为0.15mmol/LH2O2可以明显的损伤Vero细胞并在0.5h-2h内按时间相关地减小细胞存活率；2细胞损伤后,MDA浓度和OPN表达上升,而SOD水平减低；3损伤的Vero细胞容易导致草酸钙晶体的成核及聚集,诱导更多的COM结晶形成；4损伤Vero细胞表面的Zeta变化比正常细胞更为剧烈,几乎呈线性上升。5H202会明显的损伤HKC细胞,且在0.1～2mmol/L浓度范围内随着剂量的增加会使细胞存活率下降。6在细胞损伤后,MDA浓度以及OPN表达会升高,而SOD水平下降,这就会引起损伤细胞诱导的草酸钙晶体数目的增多。7正常细胞的表面初始Zeta电位高于损伤细胞,损伤细胞在c(H2O2)=0～1.5mmol/L的范围内,随其浓度的升高其细胞表面的Zeta电位呈一直下降的趋势,而加入晶体后,Zeta电位会先下降再上升的再趋于平缓。说明细胞表面Zeta电位的下降可以为CaOxa晶体粘附提供更多的位点。8通过双氧水对水溶性的大豆多糖进行降解,降解后大豆多糖去除了蛋白成分,含糖量显著的减少,且分子量由98,000降低到28,379；9降解前、后的大豆多糖均能有效的抑制COM晶体的形成,但降解后的小分子量大豆多糖体现出更强的分子活性,对草酸钙晶体的调控作用进一步的增强。10SPS可以提高损伤Vero细胞的线粒体的膜电位。11Vero细胞经SPS作用后,细胞的形貌能逐渐恢复到正常状态,且其能诱导更多COD晶体的生成。12用降解后小分子量SPS对损伤Vero细胞修复后,其诱导了尺寸较小的草酸钙聚集体。13利用3D Studio Max软件,构建出结石单晶及泌尿系结石三维模型。14采取相对简单的方法和较少的数据在个人PC机上成功构建出大鼠泌尿系参数化模型。15在手术场景中进行合并,模拟出大鼠原位,髂位及颈部肾移植情况。4讨论本研究采用化学及生物学分析的研究方法,建立了稳定的肾小管上皮细胞损伤模型,摸索出了一套细胞体外化学测试方法。这可以为生物矿化与临床诊断相结合提供了依据,利用生物统计学的方法设计实验及分析数据,使得出的结论更为客观、准确。同时利用相对较少的解剖数据,使用3D Studio Max软件模仿结石的晶体及全貌,并对大鼠的泌尿系统进行参数化构建,模拟出大鼠原位及异位肾移植场景,以满足泌尿外科动物解剖实验的需求,同时也为泌尿系流体分析及虚拟手术提供一个良好的平台。