神经病理性痛是指外伤、缺血、中毒或者机体代谢异常造成的神经病理性损伤,以痛觉过敏、触诱发痛、感觉倒错以及自发性疼痛为主要表现。背根节(Dorsal Root Ganglion, DRG)神经元是初级感觉神经元胞体的集合,是外周感觉传入的中转站。生理情况下,其主要功能是将神经末梢感受器换能产生的动作电位信息忠实的传递至脊髓,从而保证信息的完整性。然而在某些病理性条件下,如DRG受到直接或间接损伤后,神经元胞体将出现兴奋性的异常增高,产生形式多样的异位自发放电活动。该放电已被证明是产生多种异常疼痛感觉的慢性痛信号。兴奋性是指可兴奋细胞受到刺激时产生动作电位(action potential,AP)的能力,传统观念以阈值高低或产生AP的多少衡量兴奋性的高低。损伤造成的DRG兴奋性的变化,从传统的电生理检测角度观察,有阈值与适应性的变化,而基于Hodgkin-Huxley的理论,亦可表现为兴奋性类型的变化。Hodgkin于1948年在青蟹神经轴突上发现神经元兴奋性按照其刺激电流强度与放电频率之间的关系可分为三种类型[1]。第一种类型对注入电流非常敏感,第二种类型在电流强度增加时放电频率保持恒定并维持在较高水平,第三种放电类型在较高的刺激下只产生1-2个放电。我们实验室既往的工作在三叉神经中脑核神经元证实了这一分类的存在,并对二型神经元的分型标准进行了补充[2]。对于背根节,我室既往研究发现DRG神经元具有周期和簇状放电,并且表现阈下膜电位振荡活动,损伤后该比例增高。该现象提示,在DRG神经元可能存在着上述兴奋性分型的表现。Rinzel J的工作提示,不同类型兴奋性的产生是因为神经元经历了不同的从静息态到放电态的不同动力学分叉[3]。神经元兴奋性分型的确定有助于我们了解细胞在外界刺激后发生怎样的反应,即细胞对外界信息具有怎样的编码作用。同时,神经动力学系统认为,离子电流参数的改变可以导致兴奋性类型的转化。不同兴奋性类型神经元所含离子电流成分的比例不同可能导致神经元兴奋性的改变。在CCD模型[4]的诸多研究表明,神经元超兴奋的发生与一种慢失活的Na电流,又称持续Na电流(INaP)的增多有着密切关系,而CCD模型前后分型比率的变化是否也伴随着INaP电流的变化,对该问题的阐明有助于我们深入解释超兴奋发生的本质过程。结果主要包括两部分:第一部分背根神经节(DRG)神经元兴奋性的分类与转型本文拟对DRG神经元的兴奋性特征进行检测,观察是否存在上述的兴奋性分型的表现,进而在慢性背根节压迫神经病痛模型对这一分型比率是否变化进行分析,期望从兴奋性分型角度对慢性痛信号的形成作深入探讨。既往实验室在三叉神经中脑核的工作[2]还提示,INaP在细胞兴奋性分型乃至分型之间的转化中有着十分重要的作用,我们随后的工作即对分型比率变化的可能的离子通道机制进行探讨。实验运用我室创建的背根神经节慢性压迫模型(CCD模型),对背根神经节进行整节消化后,利用电流钳及电压钳的方法对DRG中、大神经元进行全细胞膜片钳记录。结果如下:1.正常DRG神经元的三种兴奋性类型:对179个正常DRG神经元施加去极化方波刺激及去极化斜波刺激,观察到三种不同的兴奋性类型。1型兴奋性神经元占13%(23/179):其阈值较低,放电频率随着刺激电流强度的增强而线性增加,在去极化斜波刺激条件下,1型神经元的放电频率随着膜电位的逐渐去极化由低到高,呈线性增加,动作电位之前没有出现阈下膜电位振荡(SMPO)。2型兴奋性神经元占27%(48/179):其阈值相对1型兴奋性神经元较高,达到阈值后,动作电位成串出现,放电频率对刺激电流的强度变化相对不敏感。在去极化斜波刺激条件下,2型神经元在膜电位去极化的过程中出现了SMPO,并在SMPO的基础上产生动作电位。3型兴奋性神经元占60%(108/179):不仅阈值电流较高,在去极化方波刺激下通常只产生1个AP,而且在去极化斜波刺激条件下,3型兴奋性神经元没有出现AP。2.正常DRG三种兴奋性类型神经元的持续钠电流(INap)实验发现INaP电流幅值在三种兴奋性类型的神经元上有显著差异,其在2型神经元上幅值最高((-394.5±58.97)pA, n=8),在3型神经元上幅值最低((-27.5±27.5)pA, n=3) ,在1型神经元上则介于两者之间((-219.333±43.5367)pA, n=10)。3. CCD模型三种兴奋性分型的比例变化在CCD模型DRG神经元三种兴奋性分型的比例变化,发现神经病理性损伤后,三种类型的分布发生了显著性改变,1型神经元明显增多,3型神经元显著减少。说明CCD模型术后3型兴奋性神经元向2型、1型兴奋性神经元转变。4. CCD模型三种兴奋性神经元INaP的变化CCD组DRG不同类型神经元INaP的电流值与正常组比较发生了明显变化,其中CCD组1型、2型兴奋性神经元的INaP有不同程度的增高。主要结论:1、正常DRG神经元存在三种兴奋性类型;INaP电流在正常三种兴奋性神经元分布明显不同。2、在CCD组神经元兴奋性分型的比例发生了显著改变;其中1与2型神经元的INaP有不同程度的增高。3、DRG神经元损伤后分型比例的变化以及INaP的增高提示神经病理性损伤导致的最终电生理变化可能与INaP的变化密切相关,而这种结果提示我们调节INaP的变化可能成为影响神经病理性损伤后电变化的重要手段。第二部分:Riluzole对INaP的抑制作用。利鲁唑(riluzole)在临床上被用来治疗神经紊乱性疾病,包括肌萎缩侧索硬化症(ALS)[5],或者作为一种神经保护剂,被用来治疗脊髓[6]和脑部损伤[7]。Riluzole同时也被用于缓解神经病理性痛,但作用靶位不清楚。目前在临床应用以及动物实验中有争论的结果要求我们对riluzole的细胞及分子机制加以研究。近来,一系列的报道提出持续钠电流(INaP)在中枢神经元中主要参与神经元兴奋性及节律的产生[8-11],而riluzole可作为INaP通道相对特异的阻断剂[12-18]。为了避免riluzole在中枢神经系统的复杂性,我们将研究其在外周初级感觉传入背根节上的细胞学效应。研究中应用了我室创建的背根节慢性压迫模型,该模型在手术侧可以诱发明显的机械触诱发痛行为[4]。本研究室发现riluzole可以抑制CCD模型DRG神经元的自发放电,发挥外周镇痛作用(见郑大伟硕士毕业论文),然而其在外周镇痛作用的具体环节与机制却不明了。为了判定持续流INaP在riluzole实现外周镇痛效应中可能发挥的重要作用,本课题利用上述检测INaP的膜片钳技术进一步对riluzole作用的细胞电生理机制进行了分析,主要结果如下:1. Riluzole通过抑制阈下膜电位振荡(subthreshold membrane potential oscillation, SMPO)进而抑制受损DRG神经元的自发放电。在CCD术后大鼠背根节离体标本上应用全细胞膜片钳技术研究了28例大中型神经元。应用时长为800ms的去极化方波注入电流刺激,其中35%神经元(10/28)表现出SMPO及高频放电。应用10μM Riluzole后SMPO消失,重复放电减少并在用药3min后消失。但该浓度并不影响其去极化诱发的首个动作电位。2. Riluzole显著抑制INaP2μM的Riluzole对INaP就有很强的抑制作用。细胞被钳制在-60mV后,应用3s的从-80到0mV的去极化斜波钳制电位来测量INaP。内向钠电流在-60~-50mV之间被激活,在-35mV左右达到峰值,并可被TTX阻断。研究结果表明损伤A类DRG神经元的INaP对riluzole的抑制有剂量依赖关系。3. Riluzole对快电流(INaT)无明显抑制作用100μM的riluzole对INaT仅有较少影响。我们测量了riluzole对TTX敏感的瞬时钠电流(INaT)的作用,发现riluzole只有在较高剂量时(500μM)才对INaT产生显著减小的影响。结论:Riluzole可能通过抑制受损背根节神经元的INaP,进而抑制异位自发放电的产生,实现外周镇痛作用。