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结核病是由于结核分枝杆菌感染而引起的慢性疾病,是目前国内外面临的一个严重的公共卫生问题。准确、简便、快速的诊断方法对于结核病的控制有着重要的意义。我国目前结核病诊断主要由临床表现结合痰涂片镜检、或细菌培养、或结核菌素皮肤试验(PPD皮试)、或X线影像检查进行。但是由于痰涂片阳性率低、细菌培养周期长、细菌培养费时长,以及PPD皮试存在假阳性、X线影像检查不特异等原因,难以满足对于结核病快速、准确诊断的需要。血清学检测技术,由于其操作简便、快速、稳定性好、无需特殊精密仪器、便于推广等优点,成为结核新诊断方法研究的热点。但目前发现的结核抗原都具有灵敏度低、特异度高的特点,没有一种单独抗原能在血清学检测时达到理想的灵敏度。本研究的旨在通过四种结核分枝杆菌主要抗原的诊断效能分析,初步建立规范的结核分枝杆菌抗原诊断效能评价体系,为结核病免疫学诊断筛选特异、有效抗原和抗原组合提供基础。本研究构建了结核分枝杆菌分泌蛋白CFP10的重组蛋白表达体,在大肠杆菌BL21中获得高效表达。CFP10基因扩增后片段大小与目的基因相符；构建的重组质粒pET30a-CFP10经酶切鉴定和测序鉴定后,证明其插入片段为目的基因。测序结果与Genbank登录序列比对后：CFP10的基因100%符合；SDS-PAGE分析显示,在IPTG诱导下,重组工程菌表达蛋白分子量(Mr)为15kDa目的蛋白条带,目的蛋白在菌体细胞内主要以可溶形式存在。研究建立了重组蛋白的纯化技术,对四种重组结核蛋白进行了纯化,蛋白纯度超过90%。采用酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay, ELISA)和受试者工作特征曲线法(Receiver Operating Characteristic Curve, ROC)建立抗原诊断效能评价体系。然后,对四种重组结核抗原的诊断效能进行分析,得出各种抗原组合的灵敏度和特异度,进而评价得出最佳的抗原组合方式。本研究建立的结核抗原诊断效能评价体系流程包括最佳ELISA反应条件的确定、ROC曲线的建立、确定各种抗原最佳临界值(Cut-off value)、最佳抗原组合方式的确定。发现本次实验中ELISA检测体系中的CFP10、38kDa、MPT64和Ag85B的最佳蛋白包被浓度分别为0.5μg/ml、2μg/ml、2μg/ml和1μg/ml,最佳血清稀释度分别为1：250、1：225、1：225和1：225。对这4种结核抗原及其不同组合的ELISA检测诊断效能进行了评价,单一抗原中的诊断效果最好的是38kDa,灵敏度为55.2%,特异度为96%, Youden指数为0.51,其余三种抗原单种使用的灵敏度从26.7%至42%不等,Youden指数均不高于0.33；组合抗原的诊断效能较好,最佳组合为38kDa+CFP10+MPT64,灵敏度为64.7%,特异度为91%,Youden指数为0.557。本研究成功建立了一种结核抗原诊断效能评价体系。通过对四种特异结核抗原诊断效能的评介,初步认为ELISA检测中以采用多组分抗原组合为佳。这套规范的结核抗原诊断效能评价体系,将对种类繁多的结核抗原进行筛选和效能评价,使结核病的血清学诊断能力有望得到进一步发展和提高。