苯丙氨酸脱氨酶（phenylalanine amminoa lyase，PAL，EC4.3.1.5）在pH8-9时催化苯丙氨酸（L-Phe）脱氨生成3-苯基丙烯酸（反式肉桂酸）和氨，pH11时催化逆反应。目前，工业上主要应用红酵母属（Rhodotorula）来源PAL催化的逆反应转化反式肉桂酸生产L-Phe。而利用其正向反应及反式肉桂酸在较低pH下析出的特性，可达到拆分消旋DL-Phe，分离更高附加值D-Phe的目的。此外，对PAL的脱氨机制和区域选择性催化机制进行探究，为分子改造提供理论依据，进而提高酶的应用性能具有重要意义。本论文克隆粘红酵母（R. glutinis）来源的RgPAL全长基因序列，并进行异源表达，制备高稳定性的固定化RgPAL，用于拆分消旋DL-Phe，生产高附加值的D-Phe。对RgPAL的催化机制和结构进行分析，用定点突变的方法获得了最适pH扩展至7的突变酶，提高了DL-Phe的拆分效率。此外，探究RgPAL底物选择性机制，通过降低110Loop的柔性获得了具有β脱氨酶活性的突变酶。具体研究结果如下：（1）克隆RgPAL全长基因，在E. coli中实现高效表达，并研究了酶学性质。R. glutinis来源的RgPAL有较高活性，但RgPAL受到细胞内调控，酶活性在菌体生长对数期达到峰值后迅速衰减，不利于工业应用。对RgPAL进行异源表达可克服上述问题，而目前仅有RgPAL编码基因3’端序列的报道。本文采用RACE技术克隆其5’端序列，拼接获得全长的基因序列。RgPAL的基因全长为2,121bp，编码706个氨基酸，蛋白分子量为75.5kDa。与同属酵母来源的冬红酵母（R. toruloides）PAL(RtPAL)的同源性为74%。在此基础上，构建E. coli表达载体pET-28-pal，在E. coli中实现高效表达，粗酶液经硫酸铵沉淀、阴离子交换和凝胶过滤层析三步纯化，获得电泳纯酶。重组酶的最佳反应温度和pH分别为50℃和pH9，比酶活达到4.2U·mg-1，在pH6-11和温度40℃条件下较稳定。（2）建立RgPAL固定化酶高效拆分DL-Phe生产D-Phe的工艺。为制备高纯度的D-Phe，采用重组RgPAL拆分DL-Phe，为提高拆分效率，重复利用酶，降低生产成本，首先需要制备高稳定性的固定化酶。本文选用介孔材料（MCM-41）为载体，并对其进行改性，克服吸附法制备固定化酶的渗漏问题，将氨基嫁接到MCM-41上，获得改性的MCM-41-NH2，然后用戊二醛（GA）与酶共价交联，获得高稳定性的固定化酶MCM-41-NH-GA-RgPAL。最佳固定化条件为载酶量50mg·g-1、戊二醛浓度0.05%(V/V)。该条件下固定化酶的活性达到游离酶的92%，最适反应温度和pH分别为55℃和pH9，重复利用30次后仍能保留80%的活性。将MCM-41-NH-GA-RgPAL装入填充床反应器，拆分消旋DL-Phe，L-Phe体积转化速率达到96.7mM·h-1，光学纯度超过99%D-Phe的产率达到1.94mM·h-1，填充反应器连续运行16个批次，转化率均在95%以上。为进一步分析工业生产的可行性，将生产过程放大25倍，D-Phe (eeD>99%)的产率达到43.6mM·h-1，产量为8.26g/L，具有一定的应用前景。（3）解析RgPAL的结构和催化机制，定点突变改造RgPAL，获得了最适pH扩展至7的突变酶，提高了DL-Phe的拆分效率。为提高DL-Phe的拆分效率，降低产物反式肉桂酸对酶活性的抑制作用，需将酶的最适作用pH移至酸性附近。RgPAL是4-methylidene-imidazol-5-one（MIO）依赖性酶，不同来源的MIO依赖性酶执行不同的脱氨机制。以L-Phe的结构类似物4-羟基苯丙氨酸和3-羟基苯丙氨酸作为探针研究RgPAL的脱氨机制，表明RgPAL执行Friedel-Crafts脱氨机制，即MIO进攻底物的苯环，活化β-质子，β-质子在酶碱基吸引下首先脱去，导致α位的氨基不稳定，氨基被酶的碱基接受后形成双键，完成脱氨过程。进一步利用分子对接研究酶活性中心与底物相互作用的关键氨基酸，结果表明136位组氨酸（His）和137位的谷氨酰胺（Gln）形成一个类似发夹的结构夹住底物的苯环，影响MIO进攻底物的苯环。当137Gln突变成谷氨酸（Glu）时，突变酶RgPAL-Q137E的最适pH扩展至7。在pH7时，RgPAL-Q137E的活性比原酶提高了1.8倍，这可能是137位突变成负电荷后有利于稳定带正电荷的中间过渡态，降低能垒。将RgPAL-Q137E用于拆分消旋体DL-Phe，在pH7的条件下，转化率和D-Phe的光学纯度分别提高了29%和48%。（4）定点突变降低RgPAL的110Loop的柔性，获得了能脱去β-Phe氨基的突变酶。对RgPAL结构分析发现，酶活性中心上方存在一个类似盖子结构的Loop，其110位的酪氨酸（Tyr）作为酶碱基接受质子，将该Loop命名为110Loop。分子动力学模拟结果表明110Loop具有高度的柔性，并有110Tyr-inner和110Tyr-outer两种构象，只有维持在110Tyr-inner构象状态下，110位的Tyr才能接受H质子，表现出脱氨酶活性。在110Loop上引入两个盐键，降低其柔性，突变酶RgPAL-S107E/T121R在40-45℃脱去L-Phe的氨基，在55-60℃时能脱去β-Phe的氨基，表明110Loop柔性控制了RgPAL的区域选择性。