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目的:岗梅（Ilex asprella）是一种岭南特色的中药材,其主要有效成分为三萜及三萜皂苷,而且大部分为熊果烷型,是研究熊果烷型三萜类化合物生物合成的理想材料。三萜类化合物结构的多样性与其生物合成途径下游的一类关键酶——细胞色素P450单加氧酶（CYP）密切相关;而细胞色素P450还原酶（CPR）是细胞色素P450系统中的重要组成部分,为CYP提供电子。因此,本研究的目的是从岗梅根转录组数据中发掘出具有三萜C-28位氧化功能的细胞色素P450单加氧酶基因（CYP）和其电子供体细胞色素P450还原酶的编码基因（CPR）,克隆并开展功能研究,转化酿酒酵母,构建生物合成通路,以期获得能够高效合成岗梅三萜中间体——熊果酸的工程菌。丰富对岗梅三萜类化合物生物合成下游途径的认知,同时为后续进一步利用代谢工程手段在酿酒酵母中生产活性岗梅三萜类化合物奠定基础。方法:1.CYP和CPR基因的筛选在岗梅根转录组数据中检索出注释为“cytochrome P450”且长度大于1200 bp的Unigene或Contig,将筛选出的CYP基因可能编码的氨基酸序列与已鉴定参与三萜氧化的CYPs氨基酸序列（共33个）合并构建系统进化树。挑选出包含完整开放阅读框的Unigene或Contig,再结合系统进化树和基因的表达量筛选出候选基因。在岗梅根转录组数据检索挑选出具有完整开放阅读框的注释为“cytochrome P450 reductase”的 Unigene 或 Contig,作为候选基因。2.目的基因的克隆和重组表达载体的构建提取岗梅嫩叶总RNA,反转录得到cDNA,根据转录组数据设计特异性的引物,以cDNA为模板,PCR扩增获得目的基因片段并将目的基因连接至零背景克隆载体,再用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit将目的基因插入表达载体,构建重组表达质粒。3.在酿酒酵母中表达CYP基因并鉴定其功能采取醋酸锂转化法将携带目的CYP基因的重组质粒转化到课题组前期构建的能够能高效合成α-amyrin的酿酒酵母工程菌株S.cerevisiae WAT11tfAX中,用半乳糖诱导CYP基因的表达,Western blot分析重组蛋白的表达情况,之后用GC-MS检测重组酵母的代谢产物,鉴定基因功能。4.构建多种酿酒酵母菌株,并分析各重组酵母菌株的代谢产物将构建的多个酵母重组表达质粒转化至酿酒酵母工程菌株S.cerevisiae WAT11tfAX中,诱导培养7天后进行代谢产物分析,并计算熊果酸的产量,对不同基因的功能进行比较。5.目的基因的原核表达将构建的大肠杆菌重组表达质粒转化至大肠杆菌表达菌株E.coli Transetta（DE3）,用1 mM的IPTG诱导CYP和CPR重组蛋白的表达。纯化目的蛋白,并对CPR蛋白的酶学性质进行分析。结果:1.筛选CYP和CPR基因从岗梅根转录组数据中,挖掘到一个可能参与三萜的C-28位氧化的CYP基因和两个CPR基因,将其分别命名为IaAO2、IaCPR1和IaCPR2。2.目的基因的克隆和重组表达载体的构建克隆得到IaAO2、IaCPR1和IaCPR2基因,并构建了酵母重组表达质粒pESC-TRP-IaAO2、pESC-TRP-IaAO2-IaCPR1、pESC-TRP-IaAO2-IaCPR2和pESC-TRP-tIaAO1和大肠杆菌重组表达质粒 pMAL-c5X-IaAO2、pET32a-tIaCPR1和 pET32a-tIaCPR2。3.IaAO2基因的功能鉴定将重组质粒pESC-TRP-IaAO2转化至酵母菌株WAT11tfAX,诱导IaAO2蛋白的表达,Western blot结果表明重组酵母能够表达与预期大小相符的IaAO2蛋白。用GC-MS分析重组酵母的代谢产物,发现IaAO2能够分别将α-amyrin与β-amyrin氧化为熊果酸和齐墩果酸,具有三萜C-28位的氧化功能。4.分析多种重组酵母中熊果酸的产量分析诱导培养7天的5种重组酵母菌株WAT11tfAX/pT-AO2、WAT11tfAX/pT-AO2-CPR1、WAT11tfAX/pT-AO2-CPR2、WAT11tfAX/pT-AO1和WAT11tfAX/pT-tAO1的代谢产物,结果表明转入了带有IaAO2基因的重组表达质粒的WAT11tfAX/pT-AO2菌株可以积累382.82μg/L熊果酸;当引入基因IaCPR1后,WAT11tfAX/pT-AO2-CPR1菌株中熊果酸的含量变化不明显;当引入基因IaCPR2后,WAT11tfAX/pT-AO2-CPR2菌株中熊果酸的含量明显提高,增加至964.73μg/L,表明IaCPR2蛋白的表达能够提高重组酵母中P450系统的催化效率。课题组前期构建的WAT11tfAX/pT-AO1菌株引入了岗梅IaAO1基因,该菌株可以积累731.70 μg/L熊果酸;将IaAO1蛋白N端截断后,tIaAO1蛋白仍然具有氧化三萜C-28位的功能,能够分别氧化底物α-amyrin和β-amyrin生成齐墩果酸和熊果酸,但其催化效率降低,积累的熊果酸含量下降为421.16 μg/L。5.IaCPR1、IaCPR2和IaAO2基因的原核表达在大肠杆菌E.coli Transetta（DE3）中成功表达了IaCPR1、IaCPR2和IaAO2重组蛋白,并对IaCPR1、IaCPR2蛋白的酶学性质开展了研究,结果表明IaCPR2蛋白具有催化活性。结论:本研究成功克隆并鉴定了两个岗梅细胞色素P450还原酶基因,IaCPR1和IaCPR2,以及一个参与岗梅三萜C-28位氧化的细胞色素P450单加氧酶基因IaAO2,其编码的蛋白能够将α-amyrin与β-amyrin分别氧化为熊果酸和齐墩果酸。并且发现与在酿酒酵母工程菌WAT11tfAX单独表达Ia4O2基因相比,共表达IaAO2和IaCPR2基因,菌株熊果酸的积累量明显提高,表明IaCPR2蛋白能够提高酵母中异源P450系统的催化效率。