研究背景与目的：三味干姜散是一组藏药成方,组成药物为干姜、白豆蔻、肉豆蔻,对于虚寒型的肝炎,肝肿大等有良好治疗效果。现代药理研究表明,干姜、豆蔻、肉豆蔻的提取物均有抗氧化活性与保肝作用,提示三味干姜散的保肝作用与抗氧化有关。本文通过三味干姜挥发油GC-MS化学成分指纹图谱及模式识别方法,研究其质量稳定性控制与评价,并在此基础上,通过动物与细胞药理实验,主要从抗氧化角度研究探讨三味于姜散的保肝作用及其机制。研究方法：水蒸气蒸馏法分别提取干姜、白豆蔻、肉豆蔻挥发油及其12个不同产地药材组成的三味干姜散挥发油,采用气相色谱一质谱(GC-MS)联用技术研究分析其分成与含量；采用模式识别法中系统聚类分析、主成分分析、相似识别分析方法研究其GC-MS指纹图谱的指标与化学成分指纹图谱共有模式,从而对三味干姜散复方总挥发油质量稳定性进行研究,为其质量评价与后续药理实验的应用提供科学的依据。三味干姜散改善慢性肝损伤大鼠的实验研究：雄性SD大鼠随机分为正常、模型、姜黄素对照、三味干姜散4组,每组10只,以CC14诱导慢性肝损伤大鼠动物模型,采用HE染色法观察病理结构,Masson胶原法染色观察纤维化的程度,解剖大鼠取肝脏组织并计算肝指数,检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)、碱性磷酸激酶(ALP)含量,测定血清PⅢNP、CIV含量,TBA法检测检测肝组织匀浆中MDA,分光光度计法检测SOD含量与GSH-Px活性,免疫组化法测检肝组织匀浆Nrf2、Bachl的蛋白量的差异。三味干姜散抗氧化保肝的作用机制研究：雄性SD大鼠随机分正常、模型、姜黄素、三味干姜散4组,每组12只,以CC14诱导慢性肝损伤大鼠动物模型,测定大鼠肝脏、脾脏和胸腺指数,HE染色观察肝脏病理变化,检测ALT、AST、MDA含量与GSH-Px活性,Western-Blot法测检大鼠肝细Nrf2、Bachl细胞核内与胞浆蛋白、H0-1总蛋白,计算Nrf2核转位率与Nrf2/Bachl比值,RT-PCR法检测Nrf2、Bach1和HO-1mRNA总水平,计算Nrf2/Bachl mRNA的比值。葡萄糖氧化酶(GO)氧化应激损伤L-02模型的建立：一是设置GO不同浓度0-200U/L11组,GO不同作用时间点0-12h 11组,通过GO不同浓度组、GO不同作用时间组损伤人肝细胞(L-02),采用细胞增殖检测(MTT法)人肝细胞(L-02)细胞存活率摸索G0损伤L-02最佳的造模时间及作用浓度。二是以上述得出的最佳浓度与作用时间GO制备人肝细胞L-02氧化损伤模型,通过检测造模后0-22h9个不同时间细胞存活率、AST、ALT、MDA, GSH-Px水平,研究GO氧化损伤模型对L-02的作用,为后续的实验研究提供可靠、稳定的损伤模型。三味干姜散含药血清对GO损伤L-02抗氧化保肝作用研究：L-02培养后分为空白血清对照组、空白血清模型对照组、三味干姜散含药血清组、乙醇对照组、乙醇模型对照组、姜黄素组,100U/L的G0作用2h制备人肝细胞L02氧化损伤模型,含药血清作用10小时后,检测细胞存活率、AST、ALT、MDA、GSH-Px水平,Western-Blot法测检L-02核内Nrf2、Bachl蛋白量,免疫荧光观察Nrf2、Bachl的表达。研究结果：一、三味干姜散质量稳定性研究结果：三味干姜散单方药挥发成份中干姜总检出102个成分,鉴定出82个化合物,白豆蔻总检出49个成分,鉴定出37个化合物,肉豆蔻总检出58个成分鉴定出40个化合物,分别占其总挥发性分成的99.21%、99.8%与98.04%。复方总挥发性成份中总检出51个化合物,鉴定出48个化合物,其中最大成分为桉油精,平均占50%以上,贡献较大的其它化合物依次为13-水芹烯,p-蒎烯,(-)-4-松油醇,a-蒎烯及α-松油醇,以上6个主要成分平均占“三味干姜散”挥发油总成分的80%以上,可代表“三味干姜散”挥发油特征性成分。三味干姜散的挥发油成分并不是单味药挥发油成分含量简单的增减,其物质变化较为明显,很多在单味药材中检识到的物质峰,而复发中并没有检识出,特别是12个复方样品中肉豆蔻醚平均含量约为2.5%,大大低于肉豆蔻单方样品中16.6%的含量,在一定程度上阐述了三味干姜散复方配伍的科学性。12个不同产地药材组成的三味干姜散,其挥发性成份主要化合物种类差异不大,样品的整体相似度较好,质量稳定,可利用其共有模式指纹图谱评价与反映药材之间的相似程度,为三味干姜散后期实验与应用提供质量稳定性评价指标。在药材的选用上,广东产肉豆蔻、海南产白豆蔻、四川产干姜组成的三味干姜散质量好,稳定性高,可作为优先选用药材。二、三味干姜散改善慢性肝损伤大鼠的实验研究结果：HE染色及Masson染色观察结果表明,与模型组比较,三味干姜散组肝细胞损伤明显减轻,肝小叶结构基本完整,肝细胞索排列整齐,只有少量坏死细胞与肝纤维化组织,胶原纤维的面密度显著降低。对比模型组,三味干姜散组大鼠的肝脏指数显著下降。与模型组比较,血清检测表明三味干姜散组大鼠血清ALT、AST, ALP显著下降；胶原检测表明该组大鼠血清胶原PIIINP、CIV值显著下降；肝匀浆抗氧化指标检测表明该组鼠肝组织中MDA的含量显著降低,GSH-Px活力与SOD含量均显著升高。免疫组化结果表明与正常组比较,模型组肝细胞浆中的Nrf2蛋白显著升高,Bachl蛋白显著降低；与模型组比较,三味干姜散组肝细胞胞浆中的Nrf2 蛋白显著降低,Bachl蛋白显著增高。三、三味干姜散抗氧化保肝的作用机制研究结果：与模型组比较,三味干姜散组大鼠的肝重与脾重指数均显著性下降,胸腺指数影响不明显,无差异；HE染色显示三味干姜散组肝小叶结构完整清晰,只有少量的脂肪变性坏死与纤维增生,纤维化程度级别明显降低；三味干姜散组血清ALT; AST水平明显降低,肝组织匀浆中MDA水平明显降低,GSH-PX明显升高。Western-Blot蛋白检测结果表明,与正常组比较,模型组肝细胞核、胞浆中的Nrf2、Bachl与HO-1总蛋白均明显升高；Nrf2、Bachl核转位率升高,核内Nrf2/Bachl的比值下降；与模型组比较,三味干姜散药物组中Nrf2蛋白在肝细胞核内的表达水平显著升高,在胞浆中的表达水平显著降低,Nrf2核转位率升高,Bachl蛋白则是无论在肝细胞核内还是胞浆中均显著降低,Bachl核转位率无明显差异；核内Nrf2/Bachl的比值与HO-1总蛋白均显著升高,显示三味干姜散对肝组织Nrf2/Bachl蛋白表达有调控作用,可以提高抗氧化酶HO-1的表达水平。基因表达变化倍数2-△△CT值显示,与正常组比较,模型组肝组织中Nrf2与Bachl的mRNA表达水平得到了升高,同时HO-1mRNA的表达水平降低。三味干姜散药物使用后,与模型组比较,药物显著升高肝组织中Nrf2与HO-1mRNA表达水平,降低Bachl的mRNA的表达水平,与两因子的总蛋白表达变化一致。相关性分析显示,HO-lmRNA的表达水平与Nrf2/Bachl的比值呈正相关(r为0.987,P<0.05)。四、葡萄糖氧化酶(GO)氧化应激损伤L-02模型建立结果：采用100U/L的G0作用2h制备人肝细胞L02氧化损伤模型；100U/L的G0作用肝细胞2h后,L-02存活率显著下降,ALT, AST均显著升高,MDA显著升高,GSH-Px活性显著下降；随着时间的推移,不同时间点,肝细胞损伤情况不同,Oh--10h氧化损伤加重,10h--22h GO氧化损伤效果逐渐减弱,L-02氧化损伤回复。五、三味干姜散含药血清对G0损伤L-02抗氧化保肝作用研究结果：三味干姜散含药血清作用后,可显著提高L-02细胞活力,降低细胞培养上清液中ALT, AST, MDA含量,升高GSH-Px活力。免疫荧光及Western blot结果显示,三味干姜散含药血清可提高Nrf2、降低Bach1在细胞核内的表达。结论：12个不同产地药材组成的三味干姜散,其挥发性成份主要化合物种类差异不大,样品的整体相似度较好,质量稳定；由广东产肉豆蔻、海南产白豆蔻、四川产干姜组成三味干姜散质量好,质量差异性小,稳定性高,可作为优先选用药材；气相色谱-质谱联用(GC-MS)-模式识别研究可用于三味干姜散挥发性成分化学成分质量稳定性控制。三味干姜散可降低肝脏指数,降低肝功指标ALT、AST、ALP值与胶原指标PIIINP、CIV值,降低抗氧化指标MDA与SOD含量,提高,提高GSH-Px活力,降低肝细胞胞浆中的Nrf2蛋白与提高Bach1蛋白水平,其改善大鼠慢性肝损伤与抗氧化有关。三味干姜的使用调节机体的氧化／抗氧化失衡,肝细胞核内Nrf2水平升高,Bachl水平降低,Nrf2核转位率提高,GSH-Px活性回复,ALT、AST、MDA降低。在基因层面,三味干姜散对两因子的mRNA表达水平影响与总蛋白一致,提高Nrf2的mRNA表达水平,降低Bachl的mRNA表达,并引起Nrf2的下游基因HO-lmRNA表达的显著提高。Nrf2、Bachl两因子水平保持着一定量的平衡,当受到外来干涉时,两者之间的平衡出现倾斜,核中Nrf2/Bach1两者的比值反映机体处于氧化／抗氧化的状况。氧化损伤期,核中蛋白Nrf2/Bach1的比值比正常组低,抗氧化治疗期,核中蛋白Nrf2 /Bachl的比值显著升高。在基因层面,mRNA表达中Nrf2/Bachl的比值也与蛋白层面一致。在下游基因层面,HO-1mRNA的表达、药物组HO-1蛋白水平也与Nrf2/Bach1的比值成正比。三味干姜散含药血清可提高Nrf2、降低Bachl在L-02细胞核内的表达,升高核内Nrf2/Bachl比值,提高L-02细胞GSH-Px活力,降低ALT、AST、MDA含量,对G0损伤L-02抗氧化保肝作用。