目前RNA已经成为大多数基因表达研究的开端,因此对不同RNA的表达丰度和空间位置进行准确的检测具有重要意义。本文旨在开发一种基于双连接探针的单分子RNA原位检测技术,拟解决基于逆转录的单分子RNA原位检测方法步骤繁复、检测效率低下以及可检测的RNA类型有限的问题。首先我们探讨了双连接探针在mRNA原位检测中的开发和应用,建立起了双连接探针在mRNA单重及多重原位检测中的实验方案。在mRNA的单重原位检测中,我们首先对双连接探针的设计进行了探索,发现对于mRNA上相同位置处不同的SplintR Ligase连接末端,不同碱基组成的连接效率从高到低依次为:CpT>TpA>ApT;其次,我们在SKBR-3、MCF-7、MDA-MB-231和T-47D这4种乳腺癌细胞系上对乳腺癌的4个生物标志基因HER2、ESR1、PGR及MKI67进行了多重检测,其结果显示,ESR1和PGR这两个基因在T-47D上的信号检出量最高,其值分别为6.22和25.27,而HER2和MKI67这两个基因则分别在SKBR-3和MDA-MB-231上有最高的信号检出量,分别为55.69和11.88。此外,我们在利用mRNA多重检测进行的相关性验证实验中发现,本方法所得结果与测序数据呈现出良好的线性相关关系(P<0.01)。基于上述结果,我们对双连接探针在lncRNA原位检测中的开发和应用进行了两方面的探索,一方面我们对MALAT1、NEAT1、CYTOR及H19这4个lncRNA在MDA-MB-231、NCI-H1299及T-47D上进行了多重原位检测,结果显示,H19和CYTOR在MDA-MB-231和NCI-H1299这两个细胞系的细胞质中均有分布;另一方面,我们在A549、SW480、NCI-H460及NCI-H1299上对MALAT1_rs3200401的3种SNP类型进行了检测,其结果表明,无论是将SNP位点设置在双连接探针的3’还是5’端,非目的信号的检出量都极低,所得结果也都与SNP测序数据具有良好的一致性。此外,我们利用本方法对miRNA的多重检测进行了尝试,其中hsa-miR-1244及hsa-miR-3648有相对较高的信号检出量,其值分别为5.36及0.60。最后,我们将本方法应用于石蜡包埋的乳腺癌组织样本中4种RNA生物标志物的多重原位检测,对8份组织样本中的3份实现了较理想的原位多重检测。综上所述,由于本方法具有较高的检测效率、特异性及灵敏度,因此有望应用于基础生物学、基础医学等领域RNA水平的基因表达研究,更有可能发展成为一种新的临床诊断手段。